1. Preparar reagentes e materiais necessários
- Prepare solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) ("tampão de lavagem"). Prepare o PBS com 2% de soro fetal de bezerro (FCS) contendo 0,1% de detergente não iônico ("tampão de lavagem permanente"; consulte a Tabela de Materiais). Prepare PBS com formaldeído a 1,5%.
nota: O formaldeído é corrosivo e potencialmente cancerígeno e deve ser manuseado com o uso de equipamento de proteção individual adequado.
- Prepare PBS contendo 2% de FBS e 0,5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para separação magnética de células ("tampão MCS").
- Preparar 50 μg/ml de isotiocianato de faloidina-fluoresceína (Faloidina-FITC) em dimetilsulfóxido (DMSO). Prepare uma coloração nuclear de 1 mg/ml (por exemplo, 1 mg/ml de 7-amino actinomicina D (7-AAD) em DMSO ou corante de bisbenzimida; ver Tabela de Materiais) em DMSO. Preparar anticorpos marcados com fluorocromo apropriados para as células de interesse e o citômetro de fluxo de imagem.
- Obter tecidos animais (por exemplo, linfonodos e baço) como fonte de células T e tecidos animais alogênicos (por exemplo, baço e medula óssea) como fonte de células apresentadoras de antígenos ou progenitores.
- Prepare o meio de cultura de células (por exemplo, Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) 1640 ou Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de FBS), 50 μM de 2-mercaptoetanol, penicilina e estreptomicina e obtenha placas de cultura de células de 24 e / ou 96 poços.
2. Preparar células apresentadoras de antígenos (APCs)
NOTA: Em teoria, qualquer população APC poderia ser examinada com este método. Células dendríticas (DCs) derivadas da medula óssea de camundongos imaturos como APCs foram processadas neste caso. Existem muitos protocolos para gerar essas células. Resumidamente, foi utilizado o seguinte protocolo.
- Lave a medula dos fêmures e tíbias em RPMI 1640 ou DMEM.
- Passe as células suspensas por um filtro de células de 70 μm para remover pequenos pedaços de osso e detritos.
- Pulverize as células por centrifugação e, em seguida, lise os glóbulos vermelhos usando um tampão de cloreto de amônio por 5 min em temperatura ambiente.
- Pulverizar as células por centrifugação (400 x g, 5 min) e ressuspender o sedimento celular.
- Lave as células em 5 a 10 mL de tampão de lavagem, pellet por centrifugação (400 x g, 5 min) e ressuspenda o pellet celular.
- Enriqueça os precursores hematopoiéticos em uma coluna de separação celular, marcando as células com anticorpos biotinilados anti-CD3 (5 μg/mL), anti-B220 (5 μg/mL), anti-MHC classe II (1 μg/mL) e anti-CD11b (5 μg/mL).
- Pulverizar as células por centrifugação (400 x g, 5 min) e ressuspender o sedimento celular.
- Incubar as células com microesferas magnéticas anti-biotina (ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante 10 min.
- Lave e pelete as células (400 x g, 5 min) e ressuspenda-as em 1 mL de tampão MCS antes de remover as células marcadas usando uma grande coluna de separação de células magnéticas de seleção positiva (LS) preparada com 3 mL de tampão MCS e colocada em seu ímã. Lave a coluna 3 vezes com 3 mL de tampão MCS; O fluxo conterá as células desejadas.
- Cultive as células que passam pela coluna por 6 dias em RPMI 1640 ou DMEM suplementado com 2 ng/mL de fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos de camundongo recombinante (GM-CSF) e 2 ng/mL de fator de crescimento transformador humano recombinante β1 (TGFβ1). Substitua metade do meio a cada 2 dias por um meio completo novo contendo 2 ng/mL GM-CSF e TGFβ1.
NOTA: O TGFβ1 humano tem atividade em células de camundongo. Os dados foram gerados usando essas DCs imaturas. Outras células (por exemplo, células B e DCs maduras) podem ser adequadas como APCs, mas não foram testadas neste ensaio.
- Criopreservar DCs em 90% de soro/10% de DMSO e armazenar em nitrogênio líquido; recuperar no dia do uso. Antes de usar, conte o número de DCs viáveis em um hemocitômetro usando a exclusão de azul de tripano. Ressuspenda o sedimento celular em meio de cultura na densidade apropriada (ver etapa 4.1) antes de usar na seção 4.
3. Prepare as células T
- Use métodos de seleção negativa para evitar a transmissão inadvertida de sinais ativadores ou inibitórios para as células.
NOTA: Neste exemplo, as células T CD4+ são preparadas para análise.
- Para preparar células T CD4 + do baço de camundongo, amasse o baço através de um filtro de células de 70 μm usando o êmbolo de uma seringa. Lave o filtro de células com tampão de lavagem.
- Pulverize as células suspensas por centrifugação (400 x g, 5 min) e, em seguida, lise os glóbulos vermelhos ressuspendendo o pellet em um tampão de cloreto de amônio por 5 min à temperatura ambiente.
- Pulverizar as células por centrifugação (400 x g, 5 min) e ressuspender o sedimento.
- Lave as células em 5 - 10 mL de tampão de lavagem e pellet por centrifugação (400 x g, 5 min). Suspenda novamente o pellet.
- Corar as células com anticorpos biotinilados para CD8, complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHC II, 1 μg / mL) e CD19 (5 μg / mL). Incubar durante 10 min a 4 °C.
- Lave as células em 10 mL de tampão de lavagem e pellet por centrifugação (400 x g, 5 min). Suspenda novamente o pellet.
- Incube as células com microesferas magnéticas anti-biotina (consulte a Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
- Lave as células em 10 mL de tampão de lavagem e pellet por centrifugação (400 x g, 5 min); ressuspenda o pellet.
- Ressuspenda as células em 1 mL de tampão MCS e enriqueça as células T CD4+ sobre uma coluna de separação de células magnéticas preparada com 3 mL de tampão MCS em um ímã. Lave a coluna 3 vezes com 3 mL de tampão MCS. O fluxo da coluna conterá as células T enriquecidas.
- Por citometria de fluxo padrão, avalie a pureza das células T usando uma alíquota das células selecionadas negativamente. Manchar as células usando um conjugado fluorocromo-estreptavidina (para identificar quaisquer células marcadas com biotina que deveriam ter sido removidas na coluna) e um anticorpo ou anticorpos para identificar a população de células T de interesse (CD4 neste caso); uma pureza de ≥85% é aceitável.
- Conte as células T em um hemocitômetro por exclusão de azul de tripano (viabilidade de ≥90% é aceitável).
NOTA: O tampão MCS contém EDTA, que deve ser removido antes do ensaio. Para conseguir isso, pelete as células por centrifugação (400 x g, 5 min) e lave-as em 1 mL de tampão de lavagem. Pulverizar novamente as células (400 x g, 5 min) e ressuspender em meio de cultura com a densidade apropriada (ver passo 4.1).
4. Co-incubar células T e DCs
- Sementes de células T e DCs em uma proporção de 2:1 T: DC em uma placa de cultura de células de 24 ou 96 poços. Certifique-se de que o volume final de cultura seja de ≤500 μL para placas de 24 poços ou ≤50 μL para placas de 96 poços.
NOTA: Volumes menores estimulam as interações célula-célula e permitem espaço para tampões de fixação subsequentes.
- Ajuste os números precisos das células empiricamente, mas como guia geral, use 1 x 106 células T e 0,5 x 106 DCs por poço (placa de 96 poços). Estes devem ser considerados o número mínimo de células porque o uso de menos células dificulta a enumeração das sinapses imunológicas.
- Para aumentar o número de células, configure os poços e o pool replicados após a etapa 5 (fixação).
NOTA: Ao configurar poços replicados, é aconselhável semear DCs em todos os poços primeiro e depois semear células T em todos os poços; Isso minimiza as discrepâncias no tempo de incubação entre os poços.
- Incubar a placa durante 4 h a 37 °C numa atmosfera de CO2 a 5%.
5. Corrigir células na placa
- Adicione 3 vezes o volume de cultura de formaldeído a 1,5% em PBS a cada poço e incube em temperatura ambiente por 30 min; é importante fixar as células antes de removê-las da placa para minimizar a interrupção das interações célula-célula.
- Transfira as células da placa para tubos para posterior lavagem e coloração. Nesta fase, reserve células adicionais para controles de coloração única. Para além destes controlos, toda a cultura deve ser corada com o cocktail de anticorpos (ver passo 4.1.1).
6. Células de coloração
- Células coradas em 100 μL de tampão de lavagem contendo um coquetel dos anticorpos conjugados com fluorocromo desejados por 30 min em temperatura ambiente, protegidos da luz.
NOTA: O coquetel inclui anticorpos específicos para células T e específicos para APC. Os fluorocromos devem ser escolhidos de modo a poderem ser distinguidos utilizando a configuração do citómetro de fluxo imagioso. Nos experimentos mostrados aqui, foram utilizados CD11b conjugado com fluoróforo azul (5 μg/mL, ver Tabela de Materiais) e CD90.2 conjugado com APC (5 μg/mL).
- Lave as células em 1 mL de tampão de lavagem e centrifugue por 5 min a 400 x g. Decantar o sobrenadante. Ressuspenda as células em tampão de lavagem permanente contendo faloidina FITC a 0,05-0,5 μg/mL e incube por 30 min em temperatura ambiente protegida da luz.
NOTA: Concentrações de faloidina FITC de cerca de 0,1 μg/mL funcionam bem para células de camundongo, mas espera-se que a concentração apropriada varie de acordo com o fornecedor, tipo de célula e citômetro de fluxo de imagem.
- Lave as células em 1 mL de permanente/tampão de lavagem e centrifugue por 5 min a 400 x g. Decantar o sobrenadante. Ressuspenda as células em tampão permanente/lavagem contendo corante nuclear na concentração apropriada (por exemplo,., aproximadamente 25 μg/mL 7-AAD) e incube por 30 min em temperatura ambiente protegida da luz.
- Lave as células em 1 mL de permanente/tampão de lavagem e centrifugue por 5 min a 400 x g. Decantar o sobrenadante. Lave as células uma vez no tampão de lavagem, pellet e ressuspenda em 50 - 100 μL de tampão de lavagem, transferindo as células para pequenos tubos de microcentrífuga tampados.
- Proceder imediatamente à aquisição de dados ou armazenar as células a 4 °C protegidas da luz durante vários dias antes da aquisição no citómetro de fluxo de imagem.
NOTA: As células foram armazenadas com sucesso dessa maneira por até 7 dias. Um armazenamento mais longo pode ser possível, mas não foi testado.
7. Adquirir dados
- Inicialize e configure o citômetro de fluxo de imagem de acordo com as instruções do fabricante. Garanta a estabilidade do núcleo de fluxo antes de coletar qualquer dado.
- Reserve um canal para aquisição de imagem de campo claro. Adquira dados de controle de mancha única com o canal de campo claro desativado.
- Clique no botão "Carregar" e insira um tubo contendo uma amostra totalmente corada (uma amostra que foi corada com todos os fluorocromos necessários) no suporte.
- Na janela "área de trabalho", selecione e crie um novo gráfico de dispersão com a proporção sobre a área e os singlets de porta onde a proporção é próxima de 1. Crie um novo gráfico de dispersão para cada canal usado (intensidade do canal no eixo horizontal).
- Para cada fluorocromo, verifique a população positiva e, se necessário, ajuste a tensão do laser na caixa "Iluminação".
- Descarregue o tubo e carregue o primeiro tubo com coloração única.
- Na caixa "Configurações de aquisição", digite o nome da amostra e defina o número de eventos que devem ser coletados; se for uma única mancha (para controles de compensação), 1.000 a 2.000 eventos são suficientes.
- Na caixa "Canais", selecione os canais com os quais cada amostra foi corada. Para controles de coloração única, todos os canais devem ser selecionados com campo claro e dispersão lateral desativados. Clique no botão "Gravar" na caixa "Aquisição"; Quando o número de eventos atingir o limite especificado, a aquisição será interrompida automaticamente.
- Clique no botão "Retornar" para descarregar o tubo. Repita as etapas 7.2.4 a 7.2.6 para cada controle de coloração única. Dependendo do citômetro e do software, pode não ser possível definir todas as portas mostradas na Figura 1 durante a aquisição (a passagem mais precisa é realizada durante a análise; consulte a seção 8).
- Adquira amostras como para amostras de coloração única (na etapa 7.2), mas na caixa "Canais", selecione todos os canais necessários, incluindo o canal de campo claro.
- Antes de registrar dados, verifique se a intensidade do canal é apropriada para identificar as populações de células desejadas. Caso contrário, ajuste as configurações do laser e grave novamente os controles de coloração única usando as novas configurações, conforme descrito na etapa 7.2.
- Para cada amostra, adquira várias dezenas de milhares de eventos.
nota: Na maioria das condições, os eventos de contato célula-célula são uma pequena minoria do número total de células (a maioria são células únicas). Em geral, é desejável ter pelo menos 100 eventos na porta de contato final da membrana.
