Identificação e Enumeração de Células Imunes no Lavado Broncoalveolar por Citometria de Fluxo

Resumo

Fonte: Van Hoecke, L. et al., Lavagem broncoalveolar de pulmões murinos para análise da infiltração de células inflamatórias.J. Vis. Exp.(2017)

Este vídeo demonstra o uso da citometria de fluxo para identificar e contar várias células imunes no fluido de lavagem broncoalveolar. Inicialmente, células imunes únicas são identificadas usando um corante de viabilidade, seguido pela coloração diferencial de proteínas marcadoras de superfície, permitindo a enumeração precisa de cada tipo de célula.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação

1. Fluido de lavagem
   1. Preparar uma solução salina equilibrada com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 100 μM).
      nota: Para medir os níveis de proteína no líquido do lavado broncoalveolar (LBA), recomenda-se adicionar inibidores de protease para evitar a atividade da protease no líquido de LBA.
2. cateter
   1. Faça um cateter inserindo uma agulha de 23 G em um tubo de polietileno de plástico transparente de 21 G (diâmetro interno: 0,58 mm, diâmetro externo: 0,965 mm e comprimento: 0,5 cm). Cateteres pré-fabricados também podem ser usados.
3. Anestésicos
   1. Prepare um anestésico terminal, de preferência um que cause parada respiratória (por exemplo, uma solução barbitúrica semelhante a pentobarbital sódico (>100 mg/kg) em solução salina tamponada com fosfato (PBS)).
      nota: Recomenda-se o uso de anestesia injetada em vez de anestesia inalatória, pois a anestesia inalada pode influenciar o conteúdo de líquido do LBA. O CO₂, por exemplo, tem influência no pH do sangue e, consequentemente, na redistribuição de diferentes compostos.
4. Tampão de lise de glóbulos vermelhos de cloreto de amônio-potássio (ACK)
   1. Prepare um tampão de lise ACK dissolvendo 8,29 g de cloreto de amônio (NH₄Cl) e 1 g de bicarbonato de potássio (KHCO₃) em 1 L de H₂O com 100 μM de EDTA; o tampão de lise dos glóbulos vermelhos também pode ser adquirido de uma fonte externa.

2. Realização da Lavagem Broncoalveolar (LBA)

1. Introduzindo o cateter na traqueia
   1. Eutanasiar o camundongo por injeção intraperitoneal de uma dose letal de um anestésico barbitúrico de ação curta usando uma agulha 26 G. Para confirmar a anestesia letal adequada, aperte a pata traseira do mouse com uma pinça para verificar o reflexo do pé.
   2. Coloque o animal de costas em uma placa cirúrgica e fixe o mouse prendendo os membros.
   3. Borrife etanol 70% no pescoço para desinfetar. Faça uma incisão na pele do pescoço perto da traqueia usando um bisturi.
   4. Abra a pele para expor as glândulas salivares. Separe as glândulas salivares usando pinças para expor o músculo esterno-hióideo. Incise o músculo ao redor da traqueia usando pinças para expor a traqueia.
   5. Coloque um fio de algodão sob a traqueia usando pinças.
   6. Perfure cuidadosamente o meio da traqueia exposta entre dois anéis de cartilagem com uma agulha de 26 G. Tome cuidado para não danificar ainda mais a traqueia.
   7. Insira o cateter cerca de 0,5 cm na traqueia. Certifique-se de que o cateter não esteja inserido muito fundo na traqueia, pois isso pode causar danos à estrutura pulmonar.
   8. Estabilize o cateter amarrando a traqueia ao redor do cateter usando o fio de algodão colocado na etapa 2.1.5. Se o cateter não estiver amarrado o suficiente, a solução salina balanceada injetada pode fluir em direção à parte superior do trato respiratório em vez de descer para os pulmões.
2. Colete o fluido de lavagem
   1. Carregue uma seringa de 1 ml com 1 ml de solução salina estéril equilibrada com 100 μM de EDTA.
   2. Conecte a seringa de 1 mL ao cateter e injete suavemente a solução de sal/EDTA no pulmão.
   3. Aspire a solução suavemente enquanto massageia o tórax do camundongo. Se o fluido aspirado não for visível na seringa, insira cuidadosamente o cateter um pouco mais para baixo ou para cima na traqueia.
   4. Remova a seringa da agulha e transfira o fluido de lavagem recuperado para um tubo de 15 mL colocado em gelo. Normalmente, 700 - 900 μL de LBA são recuperados de 1 mL de solução injetada.
   5. Repita as etapas 2.2.1 a 2.2.4 mais duas vezes.
      nota: Se o objetivo for analisar o conteúdo não celular, recomenda-se concentrar as amostras agrupadas quando houver problemas de sensibilidade.

3. Coletando os componentes celulares e não celulares do fluido de LBA

1. Centrifugue o fluido de lavagem por 7 min a 400 x g e 4 °C.
2. Colete o sobrenadante e use-o imediatamente para análises adicionais (por exemplo, ensaio de imunoabsorção enzimática, ELISA) ou congele a -80 ° C. Guarde o pellet celular para analisar o influxo celular nos pulmões.
3. Ressuspenda o pellet celular em 200 μL de tampão de lise ACK.
   nota: Esta etapa garante a lise dos eritrócitos, mantendo os glóbulos brancos intactos.
4. Incubar por 2 min em RT.
   nota: Para reduzir a variação causada pela lise dos glóbulos vermelhos, esta etapa não deve ser realizada por mais de 2 min.
5. Adicione 1 mL de PBS frio para diluir o tampão de lise ACK.
6. Centrifugar durante 7 min a 400 x g e 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células num volume adequado de PBS para análise a jusante (ver abaixo).
   nota: O volume do PBS depende do estudo a jusante que será realizado.

4. Análise dos diferentes tipos de células no fluido de LBA por citometria de fluxo

NOTA: Uma possibilidade é analisar a composição celular absoluta e relativa do líquido de LBA por meio da citometria de fluxo. O objetivo deste artigo é elaborar a técnica de LBA. A citometria de fluxo é uma técnica especializada por si só. Recomenda-se a leitura de artigos especializados sobre a técnica de citometria de fluxo. São usados anticorpos acoplados a um fluoróforo que reconhecem antígenos de superfície (ver Tabela 1) específicos para um determinado tipo de célula. Usando uma estratégia de gating, é possível identificar células T, macrófagos, células dendríticas, células B, eosinófilos e neutrófilos na fração celular do LBA.

1. Coloração da superfície celular
   nota: É importante incluir todos os controles críticos para a análise por citometria de fluxo. São necessários três conjuntos de tubos (ver Tabela 2): (1) tubos contendo as amostras; (2) tubos com células de LBA para cada anticorpo-fluoróforo para fazer colorações únicas; Isso permite a determinação das tensões para cada canal no citômetro de fluxo; e (3) tubos com grânulos para cada anticorpo-fluoróforo para fazer manchas únicas; Isso é para determinar a matriz de remuneração.
   1. Fazer uma mistura dos anticorpos e do bloqueio Fc (anti-CD16/CD32) em PBS nas diluições apropriadas (ver Tabela 2). É necessário determinar a diluição de trabalho ideal para cada anticorpo antes do experimento.
   2. Ressuspenda as células em 50 μL da mistura de anticorpos para a amostra e adicione 50 μL do anticorpo adequadamente diluído aos controles críticos.
      nota: A coloração pode ser realizada em uma placa em forma de U de 96 poços. Isso torna possível reduzir facilmente o volume da mancha e executar quantidades significativas de amostras.
   3. Incubar durante 30 min no escuro a 4 °C.
   4. Centrifugue durante 7 min a 400 x g e 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
   5. Ressuspenda as células em PBS até um volume final de 200 μL.
      nota: Este volume final depende do volume mínimo que o citômetro de fluxo pode acessar. Isso pode diferir ligeiramente entre as máquinas. Além disso, o volume de leitura depende do número de células e/ou do tempo que a amostra levará para ser executada no citômetro de fluxo.
   6. Use as amostras e controles para análise por citometria de fluxo.
      nota: Para determinar o número absoluto de células das diferentes populações de células, contas de contagem devem ser adicionadas. Adicione o mesmo número de contas (± 25.000 contas) a cada amostra imediatamente antes da medição. Usando dispersão direta e lateral, os grânulos de contagem podem ser identificados por citometria de fluxo (ver Figura 1). Posteriormente, o número absoluto de células na amostra pode ser calculado comparando a proporção de eventos de bead para eventos de células. A seguinte fórmula pode ser usada:
      
2. Análise por citometria de fluxo
   nota: A análise por citometria de fluxo deve ser feita imediatamente após a conclusão do protocolo de coloração. Deve ser utilizado um citómetro de fluxo com lasers e filtros apropriados para a detecção do sinal. O quadro 3 apresenta uma panorâmica dos lasers e filtros necessários para o estudo descrito neste manuscrito. Para obter mais informações sobre análise de citometria de fluxo, consulte Adan et al..
   1. Configure as portas primárias com base na dispersão frontal e lateral, excluindo detritos e dublês (consulte a Figura 1).
   2. Ajuste a tensão e a compensação da sobreposição espectral com a ajuda das células e grânulos de coloração única.
      nota: Essas configurações são diferentes para cada citômetro de fluxo e precisam ser verificadas antes de cada experimento. Para uma análise de fluxo correta, as tensões de dispersão direta e lateral são críticas. Uma dispersão direta e lateral correta pode ajudar na identificação e confirmação da identidade das células analisadas. Para determinar essas tensões, uma amostra não corada deve ser executada primeiro.
   3. Configure portas de fluorescência para o antígeno de superfície (veja a Figura 1) e analise as amostras.

Tabela 1: Seleção de antígenos de superfície de células imunes. Esta tabela fornece uma lista de epítopos de superfície usados para caracterizar os diferentes tipos de células. Combinações de vários marcadores serão necessárias para definir de forma confiável um tipo de célula específico.

antígeno	Tipo de célula
Cluster de diferenciação 3 (CD3)	Expresso em células T
Cluster de diferenciação 11c (CD11c)	Alta expressão na maioria das células dendríticas, mas também em monócitos, macrófagos, neutrófilos e algumas células B.
Cluster de diferenciação 11b (CD11b)	Expresso na superfície de muitos leucócitos, incluindo monócitos, neutrófilos, células natural killer, granulócitos e macrófagos.
SiglecF	Macrófagos alveolares e eosinófilos.
MHCII	Normalmente encontrada apenas em células apresentadoras de antígenos, como células dendríticas, fagócitos mononucleares e células B.
CD19	Antígeno do linfócito B
Ly-6G	Um marcador para monócitos, granulócitos e neutrófilos

Tabela 2. Lista de controles a serem incluídos. Esta tabela mostra todos os controles necessários para a interpretação precisa dos resultados obtidos.

Amostras
tubo	Antígeno-fluoróforo a ser adicionado às células	Concentração de estoque de anticorpos (mg/mL)	Diluição de anticorpos	Volume total (μL)
	Corante de viabilidade fixável	0,2	1/1000	50
	CD11c	0,2	1/800	50
	SiglecF	0,2	1/100	50
amostra X	MHCII	0,2	1/200	50
	CD3	0,2	1/200	50
	CD19	0,2	1/200	50
	CD11b	0,2	1/200	50
	Ly6G	0,2	1/200	50
Controles de tensão
tubo	Antígeno-fluoróforo a ser adicionado às células	Concentração de estoque de anticorpos (mg/mL)	Diluição de anticorpos	Volume total (μL)
Células não coradas	/	/	/	50
Células com coloração única	Corante de viabilidade fixável	0,2	1/1000	50
Células com coloração única	CD11c	0,2	1/800	50
Células com coloração única	SiglecF	0,2	1/100	50
Células com coloração única	MHCII	0,2	1/200	50
Células com coloração única	CD3	0,2	1/200	50
Células com coloração única	CD19	0,2	1/200	50
Células com coloração única	CD11b	0,2	1/200	50
Células com coloração única	Ly6G	0,2	1/200	50
Controles de compensação
tubo	Antígeno-fluoróforo a ser adicionado aos grânulos	Concentração de estoque de anticorpos (mg/mL)	Diluição de anticorpos	Volume total (μL)
Contas não manchadas	/	/	/	200
Miçangas de coloração única	CD11c	0,2	1/2000	200
Miçangas de coloração única	SiglecF	0,2	1/2000	200
Miçangas de coloração única	MHCII	0,2	1/200	200
Miçangas de coloração única	CD3	0,2	1/2000	200
Miçangas de coloração única	CD19	0,2	1/2000	200
Miçangas de coloração única	CD11b	0,2	1/400	200
Miçangas de coloração única	Ly6G	0,2	1/200	200

Tabela 3: Visão geral dos lasers e filtros do citômetro de fluxo usado neste estudo.

Tipo de laser	Configuração do filtro
	505 de PdL	525/50
Azul (488 nm)	550 Pontos de Vida	Rolamento 575/26
100 mW	670 PdL	Nº 685/35
	750 de PdL	780/60
violeta 405 nm		450/50
100 mW
vermelho 633 nm		Rolamento 660/20
70 mW	750 de PdL	780/60

Resultados

Figura 1: Estratégia de gating para a detecção por citometria de fluxo de macrófagos, células dendríticas, células T, células B, neutrófilos e eosinófilos no líquido de LBA. As células de LBA foram isoladas usando o protocolo de LBA descrito. As células foram isoladas de camundongos 24 h após instilação intratraqueal de lipopolissacarídeo. A contagem de grânulos e células foi identificada com base na...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina balanceada	Thermo Fisher Científico	Rolamento 14175-129
Ácido etilenondiaminotetraacético	Sigma-Aldrich	E6511	irritante
23G x 1 1/4 agulha	Henke Sass Wolf	4710006030	Tamanho: 0,60 x 30 mm
26G x 1/2 neelde	Henke Sass Wolf	4710004512	Tamanho: 0,45*12 mm
Tubulação plástica	Tecnologia médica BD	427411	Tubulação de polietileno, ID 0,58 mm (0,023") OD. 965 mm (0,38") 30,5 m (100 pés)
Pentobarbital sódico	Kela NV	514
Solução salina tamponada com fosfato	Lonza	BE17-516F	PBS sem Ca++ Mg++ ou vermelho de fenol; filtrado estéril
Seringas de 1ml	Henke Sass Wolf	Rolamento 5010.200V0	não pirogênico e não tóxico
fórceps	Fine Science Tools GmbH	Rolamento 91197-00
Tesoura cirúrgica	Fine Science Tools GmbH	Rolamento 91460-11
Tubo de centrífuga 50 ml	ésimo. Geyer	7696705	Livre de Rnase/Dnase/endotoxina
Tubo de centrífuga 15 ml	ésimo. Geyer	7696702	Livre de Rnase/Dnase/endotoxina
Tubo de microcentrífuga 1,5 ml	Sigma-Aldrich	0030 120.094	polipropileno
Microcentrífuga	Sigma-Aldrich	5415R
centrifuga	Thermo Fisher Científico	75004030
Tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK)	Lonza	10-548E	Filtrado estéril
Vivo/morto -efluor506	eBiociência	Telefone: 65-0866-18	Corante de viabilidade fixável
CD11c-PE-cy7	eBiociências	25-0114-81
SiglecF-PE	BD Pharmingen	552126
MHCII-APCefluor780	Biolenda	107628
CD3-PE-cy5	VWR	55-0031-U100
CD19-PE-cy5	eBiociências	15-0193-83
CD11b-V450	BD Pharmingen	560455
Ly6G-AF700	Biolenda	127621
Grânulos de contagem absoluta	Life Technologies Europe B.V.	C36950
anti-CD16/CD32	BD Pharmingen	553142
Placa de armazenamento de 96 poços e 340 μl	falcão	353263	Fundo em V, polipropileno natural
Citômetro de fluxo	BD Biociências
cateter	BD Biociências	393202