Identificação e Enumeração de Células Imunes no Lavado Broncoalveolar por Citometria de Fluxo

Resumo

Fonte: Van Hoecke, L. et al., Lavagem broncoalveolar de pulmões murinos para análise da infiltração de células inflamatórias.J. Vis. Exp.(2017)

Este vídeo demonstra o uso da citometria de fluxo para identificar e contar várias células imunes no fluido de lavagem broncoalveolar. Inicialmente, células imunes únicas são identificadas usando um corante de viabilidade, seguido pela coloração diferencial de proteínas marcadoras de superfície, permitindo a enumeração precisa de cada tipo de célula.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação

1. Fluido de lavagem
   1. Preparar uma solução salina equilibrada com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 100 μM).
      nota: Para medir os níveis de proteína no líquido do lavado broncoalveolar (LBA), recomenda-se adicionar inibidores de protease para evitar a atividade da protease no líquido de LBA.
2. cateter
   1. Faça um cateter inserindo uma agulha de 23 G em um tubo de polie....

Resultados

Figura 1: Estratégia de gating para a detecção por citometria de fluxo de macrófagos, células dendríticas, células T, células B, neutrófilos e eosinófilos no líquido de LBA. As células de LBA foram isoladas usando o protocolo de LBA descrito. As células foram isoladas de camundongos 24 h após instilação intratraqueal de lipopolissacarídeo. A contagem de grânulos e células foi identificada com base na.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina balanceada	Thermo Fisher Científico	Rolamento 14175-129
Ácido etilenondiaminotetraacético	Sigma-Aldrich	E6511	irritante
23G x 1 1/4 agulha	Henke Sass Wolf	4710006030	Tamanho: 0,60 x 30 mm
26G x 1/2 neelde	Henke Sass Wolf	4710004512	Tamanho: 0,45*12 mm
Tubulação plástica	Tecnologia médica BD	427411	Tubulação de polietileno, ID 0,58 mm (0,023") OD. 965 mm (0,38") 30,5 m (100 pés)
Pentobarbital sódico	Kela NV	514
Solução salina tamponada com fosfato	Lonza	BE17-516F	PBS sem Ca++ Mg++ ou vermelho de fenol; filtrado estéril
Seringas de 1ml	Henke Sass Wolf	Rolamento 5010.200V0	não pirogênico e não tóxico
fórceps	Fine Science Tools GmbH	Rolamento 91197-00
Tesoura cirúrgica	Fine Science Tools GmbH	Rolamento 91460-11
Tubo de centrífuga 50 ml	ésimo. Geyer	7696705	Livre de Rnase/Dnase/endotoxina
Tubo de centrífuga 15 ml	ésimo. Geyer	7696702	Livre de Rnase/Dnase/endotoxina
Tubo de microcentrífuga 1,5 ml	Sigma-Aldrich	0030 120.094	polipropileno
Microcentrífuga	Sigma-Aldrich	5415R
centrifuga	Thermo Fisher Científico	75004030
Tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK)	Lonza	10-548E	Filtrado estéril
Vivo/morto -efluor506	eBiociência	Telefone: 65-0866-18	Corante de viabilidade fixável
CD11c-PE-cy7	eBiociências	25-0114-81
SiglecF-PE	BD Pharmingen	552126
MHCII-APCefluor780	Biolenda	107628
CD3-PE-cy5	VWR	55-0031-U100
CD19-PE-cy5	eBiociências	15-0193-83
CD11b-V450	BD Pharmingen	560455
Ly6G-AF700	Biolenda	127621
Grânulos de contagem absoluta	Life Technologies Europe B.V.	C36950
anti-CD16/CD32	BD Pharmingen	553142
Placa de armazenamento de 96 poços e 340 μl	falcão	353263	Fundo em V, polipropileno natural
Citômetro de fluxo	BD Biociências
cateter	BD Biociências	393202