1. Configuração de ensaios MIC90 replicantes e não replicantes
- Inocule M. tuberculosis, M. bovis BCG ou M. smegmatis em um OD580 de 0,01-0,1 e expanda para a fase intermediária (OD580 ~ 0,5) em Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 contendo 0,2% de glicerol, 0,2% de dextrose, 0,5% de albumina e 0,085% de NaCl) ou 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 contendo 0,2% de glicerol e 10% de suplemento de OADC).
- Cultive M. tuberculosis e M. bovis BCG como ~ 20 ml de culturas permanentes em frascos de cultura de células e M. smegmatis com agitação em polipropileno de fundo redondo (cultura de 4 ml) ou tubos de centrífuga cônicos de 50 ml (cultura de 10-20 ml). Incubar micobactérias patogênicas a 37 ° C com 20% de O2 e 5% de CO2, e M. smegmatis a 37 ° C com 20% de O2.
- Estabelecer um experimento no estilo de concentração inibitória mínima (MIC90) sob condições replicantes e não replicantes (Figura 1).
nota: Os agentes de teste são geralmente testados em duplicatas ou quadruplicados para permitir o teste de 4 ou 2 compostos, respectivamente, por microplaca de 96 poços. Por exemplo, em uma placa de 96 poços, um agente de teste pode ser analisado nas linhas A-D e outro nas linhas E-H. O DMSO (veículo) está nas colunas 1, 2 e 12, e a série de diluição do agente de ensaio vai da coluna 3 (concentração mais baixa) à coluna 11 (concentração mais elevada). Os ensaios do tipo MIC90 normalmente empregam uma série de diluição de 2 vezes. Existem inúmeros modelos não replicantes disponíveis para micobactérias e, para fins ilustrativos, estamos usando um modelo multiestresse de não replicação.
- Para o ensaio de replicação, distribuir 200 μl de células em 7H9-ADN a uma DO580 de 0,01 em todos os alvéolos de uma placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos de fundo transparente.
- Para o ensaio não replicante, lave as células duas vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,02% de tiloxapol e ressuspenda as células em meio não replicante (0,05% KH2PO4, 0,05% MgSO4, 0,005% citrato de amônio férrico, 0,0001% ZnCl2, 0,1% NH4Cl, 0,5% BSA, 0,085% NaCl, 0,02% tiloxapol, 0,05% butirato; pH ajustado para 5,0 com 2 N NaOH).
- Diluir as células até um OD580 de 0,1 em um meio não replicante e adicionar NaNO2 de um estoque de 1 M recém-preparado até uma concentração final de 0,5 mM.
- Distribua 200 μl de células a uma DO580 de 0,1 em todos os poços de uma placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos de fundo transparente.
nota: Prepare diluições compostas como soluções estoque de 100 vezes em DMSO. Assim, uma placa MIC típica testando o impacto de uma molécula em uma concentração final de 0,4-100 μg / ml exigiria soluções de estoque de 0,04-10 mg / ml em DMSO.
- Adicionar 2 μl de diluições do agente de ensaio 1 nas linhas A-E e 2 μl de diluições do agente de ensaio 2 nas linhas E-H. Homogeneizar.
- Adicione 2 μl de controle de veículo (geralmente DMSO) em poços de controle, colunas 1, 2, 12 (linhas AH). Homogeneizar.
- Para cada experimento, incluir pelo menos um controle positivo, como rifampicina, de 0,004 a 1 μg/ml (ensaio replicante) e/ou 0,08 a 20 μg/ml (ensaio não replicante).
nota: O uso de 6-bromo-1H-indazol-3-amina9 a 0,1 a 25 μg / ml é recomendado como um composto controle que tem atividade seletiva dependente de NaNO2 no modelo de não replicação de estresse múltiplo.
- Para ensaios de replicação, incubar microplacas a 37 °C a 20% deO2 e 5% de CO2 durante 7 dias (M. tuberculosis e M. bovis BCG) ou 1-48 horas (M. smegmatis). Para o modelo multiestresse de não replicação, incubar microplacas por 7 dias a 37 ° C a 1% O2 e 5% CO2 (M. tuberculosis e M. bovis BCG).
2. Inoculação de microplacas CARA
- Nos momentos em que o CARA será usado como leitura, ressuspenda cuidadosamente o conteúdo do poço da placa de ensaio estilo MIC90 usando uma pipeta multicanal p200 ajustada em 50-75 μl. Pipete para cima e para baixo pelo menos 5-10 vezes e gire suavemente o conteúdo do poço em movimentos circulares usando as pontas da pipeta.
- Transfira 10 μl do conteúdo do poço de ensaio para a microplaca CARA. Certifique-se de que a ordem do conteúdo do poço na placa de ensaio corresponda à ordem do conteúdo do poço da microplaca CARA. Evite respingos durante as transferências e certifique-se de que os 10 μl estejam localizados no meio dos poços de microplacas CARA. Confirme se os 10 μl são absorvidos pela microplaca CARA.
nota: Não há diluições necessárias antes de detectar células nas microplacas CARA.
- Amarre pilhas de microplacas CARA com fita adesiva e coloque-as em um saco plástico que possa ser fechado novamente. Incubar microplacas CARA a 37 ° C com 20% de O2 (M. smegmatis) ou 1% de O2 e 5% de CO2 (M. tuberculosis e M. bovis BCG).
- Para M. tuberculosis e M. bovis BCG, ensaios replicantes: incubar por 7 dias; para M. tuberculosis e M. bovis BCG ensaios não replicantes, incubar por 10 dias; para M. smegmatis, ensaios replicantes, incubar por 1-2 dias; para M. smegmatis, ensaios não replicantes, incubar 2-3 dias.
NOTA: Os tempos são estimativas e podem ser modificados de acordo com diferentes condições de replicação, não replicação e estresse.
3. Desenvolvimento de microplacas CARA
- Desenvolva as microplacas CARA quando um filme de crescimento bacteriano, ou colônias macroscópicas maiores, forem visíveis nos poços de controle negativo (veículo).
nota: Após incubação prolongada, os poços de microplacas CARA geralmente parecem secos e recomendamos pré-umedecer o conteúdo do poço com PBS estéril. Isso serve para evitar que o carvão absorva a resazurina, o que pode levar a baixa fluorescência ou variação de poço a poço.
- Usando um único conjunto de 12 ponteiras p200 com uma pipeta multicanal, dispense 40 μl de PBS estéril ao longo da lateral dos poços e permita que o PBS se distribua pela parte superior das microcolônias de ágar / bactérias.
- Prepare o reagente de revelação CARA misturando 5 mg de resazurina (0,01% final) e 50 ml de Tween-80 a 5% em PBS. Vórtice e filtro estéril.
nota: Um reagente alternativo de revelação CARA pode ser preparado misturando solução líquida de resazurina preparada comercialmente a 1:1 (vol/vol) com 10% de Tween80 em PBS.
- Adicione 50 μl de reagente revelador CARA recém-preparado a cada poço da microplaca CARA usando uma pipeta de 12 canais. Balance as placas para frente e para trás algumas vezes para ajudar a distribuir os reagentes pelo ágar e pelo tapete bacteriano em cada poço.
- Colocar as placas num saco de plástico que possa voltar a fechar e incubar a 37 °C durante pelo menos 30 min para M. smegmatis e 45-60 min para M. tuberculosis ou M. bovis BCG.
nota: Se os poços de controle do veículo não ficarem rosa na primeira hora, as placas podem ser ensacadas novamente e incubadas por períodos mais longos.
- Antes de ler a fluorescência, coloque as microplacas CARA em uma capa de biossegurança por 15 min em temperatura ambiente com as tampas removidas. Ao usar espectrofotômetros BSL3 fora de um gabinete de biossegurança, cole um adesivo de PCR de qualidade óptica sobre a placa e feche firmemente pressionando suavemente a superfície do adesivo com uma toalha de papel macia.
- Determinar a fluorescência através da leitura superior com excitação a 530 nm e emissão a 590 nm. Não é necessário deixar a placa em branco.
