1. Preparação de meios e reagentes
- Prepare meios de fibroblastos. Combine 450 mL do meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 50 mL de soro fetal bovino (FBS) e 5 mL de penicilina/estreptomicina. Conservar a 4 °C até 3 meses.
- Preparar o meio de crescimento de macrófagos repórteres em alíquotas de 50 ml. Combine 45 mL de DMEM, 5 mL de FBS, 5 μg / mL de reagente de eliminação de micoplasma (Tabela de Materiais) e 200 μg / mL de fleomicina D1 (Tabela de Materiais). Conservar a 4 °C até 3 meses.
- Prepare o meio repórter de ensaio de macrófagos em alíquotas de 50 mL. Combine 45 mL de DMEM, 5 mL de FBS (HI-FBS), 5 μg / mL de reagente de eliminação de micoplasma e 200 μg / mL de fleomicina D1. Conservar a 4 °C até 3 meses.
2. Revestindo superfícies de cultura de células com poli(metacrilato de metila)
- Dissolva o poli (metacrilato de metila) (PMMA) em clorofórmio a 20 mg / mL (por exemplo, 100 mg de PMMA em 5 mL de clorofórmio) em um frasco de cintilação de vidro de 20 mL. Coloque uma barra de agitação magnética no frasco para injetáveis e deixe mexer por pelo menos 2 h, até que todos os sólidos estejam dissolvidos.
cuidado: O clorofórmio é prejudicial se inalado. Certifique-se de usar solvente em uma capela de exaustão enquanto estiver usando luvas de PVA.
- Pipete 400 μL de solução de PMMA no centro de uma lâmina de microscópio de vidro de borossilicato em um revestidor de rotação e gire a 3000 rpm por 2 min. Prepare o número de lâminas necessárias para o ensaio, bem como 3−5 extras para medição do ângulo de contato com a água. Armazene as lâminas em uma caixa limpa (pulverizada e limpa com etanol 70%) para uso futuro.
nota: O revestimento giratório é frequentemente usado para depositar um revestimento fino e uniforme em uma superfície plana. Um revestidor giratório gira um substrato em altas velocidades, usando força centrífuga para espalhar a solução de revestimento sobre a superfície.
- Meça o ângulo de contato com a água em duas posições aleatórias na superfície das lâminas extra revestidas (ou seja, não as lâminas usadas para cultura de células) com um goniômetro para garantir que a superfície do vidro foi completamente revestida com o polímero.
NOTA: Somente água da mais alta pureza (por exemplo, vidro triplamente destilado) deve ser usada para medições do ângulo de contato com a água.
- Em um gabinete de segurança biológica (BSC), conecte poços pegajosos de 8 câmaras a lâminas revestidas com PMMA usando uma pinça estéril e seguindo a técnica asséptica. Pressione firmemente a parte superior dos poços pegajosos para certificar-se de que estão fortemente presos. Incube as lâminas com poços pegajosos fixados a 37 °C durante a noite para garantir a vedação.
- Teste a vedação dos poços pegajosos adicionando 200 μL de água de grau de cultura de células (livre de endotoxinas) a cada poço. Incube em temperatura ambiente (RT) por 60 min e certifique-se de que não haja vazamento antes de prosseguir. Aspire a água, tomando cuidado para não perturbar o revestimento de PMMA.
- Realize lavagens com água sem endotoxinas adicionando 300 μL de água sem endotoxinas a cada poço e incubando por 1 h (três vezes), 12 h e 24 h antes do uso para remover qualquer solvente restante.
- Testar a concentração de endotoxinas das lâminas a utilizar para cultura de células. Incubar 200 μL de água reagente livre de endotoxinas (Tabela de Materiais) em um poço de cada lâmina por 1 h. Meça a concentração de endotoxina no extrato usando um ensaio de endotoxina cromogênica de ponto final (Tabela de Materiais).
nota: O protocolo a seguir é específico para o kit de ensaio de endotoxina listado na Tabela de Materiais.
- Use apenas água e consumíveis (ou seja, pontas de pipeta, tubos de microcentrífuga e placas de poço) certificados como livres de pirogênio (ou seja, livres de endotoxinas) para este trabalho. Além disso, qualquer vidraria usada na preparação das superfícies revestidas com polímero deve ser despirogenizada usando esterilização por calor seco (250 ° C por 30 min) antes do uso. A medição da endotoxina na solução do extrato, conforme descrito aqui, pode resultar em uma subestimação da endotoxina na superfície do material. Consequentemente, recomenda-se que, ao desenvolver um protocolo de revestimento de polímero, realize a reação de ensaio de endotoxina (ou seja, etapas 2.6.4 a 2.6.6 para amostras de teste [água reagente] ou controles de pico) diretamente dentro dos poços contendo a amostra revestida para garantir que nenhuma fonte de endotoxina seja introduzida inadvertidamente no sistema durante o processo de revestimento.
- Traga todas as amostras de teste (ou seja, extratos) e reagentes de ensaio de endotoxina para RT. Reconstitua o reagente cromogênico em tampão de ensaio e padrão de endotoxina em água reagente, deixe dissolver por 5 min e gire suavemente antes de usar. Cubra todos os frascos com filme de parafina quando não estiverem em uso.
- Crie uma curva de diluição padrão de 5 a 8 pontos do padrão de endotoxina variando do limite inferior ao superior do ensaio, realizando uma diluição em série do padrão de endotoxina em água reagente.
- Para controlar o aprimoramento ou inibição do ensaio de endotoxina em amostras de teste, prepare um controle positivo (também chamado de controle de pico ou amostra enriquecida) diluindo uma quantidade conhecida de endotoxina em uma solução de amostra de teste não utilizada.
nota: A concentração do controlo positivo deve ser a mesma concentração que um padrão no meio da curva-padrão. Se a quantidade recuperada do pico de endotoxina (ou seja, a concentração do controle positivo menos a concentração da amostra de teste não enriquecida) estiver dentro de 50-200% da concentração nominal do pico de endotoxina, a solução de extração pode ser considerada como não interferindo significativamente no ensaio.
- Adicione 50 μL de padrões, amostras ou controles de pico a cada poço de uma placa de 96 poços em duplicata ou triplicada. Use água reagente como controle negativo.
- Adicione 50 μL de reagente cromogênico a cada poço. Adicione reagente rapidamente a todos os poços. Use um temporizador para registrar a quantidade de tempo que leva para adicionar reagente a todos os poços. Cobrir a placa com um selo adesivo e incubar a 37 °C (o tempo de incubação depende do lote e consta do certificado de análise incluído no kit de reagentes cromogénicos). Como alternativa, verifique a placa a cada 15 minutos durante a incubação até que uma mudança de cor seja observada em todos os poços padrão.
- Após a incubação, adicione 25 μL de ácido acético a 50% a cada poço (concentração final de ácido acético a 10% por poço) para interromper a reação. Adicione ácido acético na mesma ordem em que o reagente cromogênico foi adicionado. Ler a absorvância da placa utilizando um leitor de placas a 405 nm. Aspirar líquido e descartar placa.
nota: A adição de ácido acético deve levar o mesmo tempo para adicionar a cada poço que o reagente cromogênico levou (± 30 s).
- Esterilize as lâminas por ultravioleta (UV) por 30 minutos antes dos experimentos de cultura de células.
3. Fazendo lisado a partir de células 3T3
- Cultive células 3T3 em vários frascos T150 até 70% de confluência. Para desprender as células, aspire o meio, lave a superfície com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e aspire PBS. Adicione 5 mL de enzima de dissociação celular recombinante livre de origem animal (Tabela de Materiais) e incube a 37 ° C por 3-5 min.
- Separe as células inclinando suavemente o frasco para frente e para trás. Adicione 5 mL de PBS para neutralizar a enzima recombinante usada para dissociação celular. Transferir as células separadas dos frascos para um tubo de centrifugação e misturar por pipetagem. Realize uma contagem de células vivas usando um hemocitômetro e corante de viabilidade celular.
nota: Uma enzima de dissociação celular que pode ser neutralizada por diluição em PBS foi selecionada para evitar a introdução de proteínas à base de soro na preparação do lisado. Se a tripsina for usada para dissociar as células, ela deve ser neutralizada com uma solução contendo soro e uma lavagem adicional de PBS deve ser realizada para reduzir a quantidade de proteínas séricas transportadas para a preparação de lisado.
- Centrifugue as células a 200 x g durante 5 min. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células no volume original (ou seja, 10 ml x número de frascos) de PBS para lavar qualquer meio restante. Repetir.
- Centrifugar novamente as células a 200 x g durante 5 min e aspirar o sobrenadante. Adicione o volume de PBS necessário para atingir uma concentração celular final de 1 x 106 células/mL. Colocar a solução celular num congelador a -80 °C até que a amostra esteja totalmente congelada (pelo menos 2 h).
- Descongelar a solução celular em banho-maria a 37 °C. Depois de completamente descongelada, colocar a solução de volta no freezer a -80 °C até que esteja totalmente congelada. Repita para um total de 3 ciclos de congelamento e descongelamento.
- Realize um ensaio de ácido microbicinconínico (BCA) no lisado celular em uma variedade de diluições (por exemplo, 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) para determinar a concentração de proteína. Diluir o lisado celular até uma concentração de proteína de 468,75 μg/mL, alíquota, e armazenar a -80 °C para uso futuro.
nota: A concentração final de proteína em uma placa de 48 poços é de 125 μg/cm2 (com base na área de superfície de um poço, 0,75cm2).
- Realize um Western blot para avaliar a presença de DAMPs no lisado (por exemplo, proteína de choque térmico 60 [HSP60], caixa de grupo de alta mobilidade 1 [HMGB1]) carregando 40-60 μg de proteína lisada no tampão de carregamento em um gel de poliacrilamida a 10% de 1,5 mm de espessura e siga os procedimentos padrão de Western blot.
4. Avaliação do efeito de camadas de proteínas adsorvidas e receptores toll-like na atividade de NF-κB de macrófagos
NOTA: Para obter um esquema do fluxo de trabalho experimental e do layout da placa, consulte a Figura 1A e a Figura 2, respectivamente.
- Cultive macrófagos repórteres em um frasco de tamanho apropriado até 70% de confluência. Aspire o meio, lave a superfície com PBS e aspire o PBS. Adicionar a enzima de dissociação celular recombinante e incubar a 37 °C durante 8 min.
- Separar as células batendo firmemente nas laterais do frasco. Inative a enzima de dissociação celular recombinante adicionando um volume igual de meio de crescimento (contendo 10% de FBS). Realize uma contagem de células vivas usando um hemocitômetro e corante de viabilidade celular.
nota: A viabilidade esperada para os macrófagos repórteres após uma incubação de 8 minutos na enzima de dissociação celular é de 90%.
- Centrifugue as células a 200 x g por 5 min. Aspire o sobrenadante e ressuspenda no volume original de PBS para lavar as células. Centrifugue novamente e ressuspenda as células a 7,3 x 105 células / mL em meio de ensaio (contendo FBS inativado por calor).
- Separe a suspensão celular em 3 tubos diferentes: inibidor de TLR4, anti-TLR2 e não tratado. Incube as células com 1 μg/mL de inibidor de TLR4 por 60 min em RT ou com 50 μg/mL anti-TLR2 por 30 min em RT.
- Adicione 200 μL de lisado, 10% de FBS, 10% de plasma comercial de camundongo (Tabela de Materiais) ou uma mistura das soluções de proteína a uma placa de 48 poços (ou equivalente) e deixe a proteína adsorver a 37 ° C pelo tempo desejado (ou seja, 30 min, 60 min ou 24 h). Aspire soluções de proteína de poços, usando uma pipeta Pasteur fresca para cada solução de proteína, e lave as superfícies com 250 μL de PBS por 5 min. Repita para um total de 3 lavagens.
nota: Esta etapa pode precisar ser iniciada mais cedo no protocolo, dependendo do tempo de adsorção desejado. Ajuste o protocolo de acordo.
- Após o período de incubação com o inibidor de TLR4 ou anti-TLR2, pipetar as células para ressuspender. Adicione 200 μL de solução celular a cada poço.
- Para a condição de controle positivo para TLR2, adicione Pam3CSK4 (Pam3Cys-Ser-(Lys)4) a uma concentração final de 150 ng/mL. Para a condição de controle positivo TLR4, adicione lipopolissacarídeo (LPS) a uma concentração final de 1,5 μg / mL. Incubar as células a 37 °C durante 20 h.
- Amostra de 20 μL de sobrenadante de cada poço e placa em duplicata em uma placa de 96 poços. Incluir três poços de meios de ensaio de 20 μL como controlo de fundo. Adicione 200 μL de reagente de ensaio repórter SEAP a cada poço. Cubra a placa com um selo adesivo e incube por 2,5 h a 37 °C.
nota: O tempo de incubação pode variar dependendo das condições experimentais e deve ser otimizado para uma forte diferença na absorbância entre os poços de controle positivo e negativo.
- Transfira o restante do sobrenadante para um tubo de 1,5 mL (por poço). Centrifugue a 1.000 x g por 10 min para peletar quaisquer detritos. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL e armazene-o a -80 °C. Analise o sobrenadante quanto à presença de citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina 6) por meio de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA).
- Remova a vedação da placa adesiva. Ler a absorvância da placa utilizando um leitor de placas a 635 nm. Aspire o líquido e descarte a placa.
