1. Geração de lentivírus codificador de CAR
NOTA: Uma vez concluída a construção do plasmídeo de células T do receptor de antígeno quimérico específico (CAR) (CD47 e outros), os CARs lentivirais são gerados pelo procedimento padrão, usando células de 293 FT, uma mistura de embalagem lentiviral e agentes de transfecção (consulte a Tabela de Materiais) conforme descrito. Posteriormente, use um kit quantitativo de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) e um termociclador (consulte a Tabela de Materiais) para determinar o título do vírus medindo a quantidade de RNA lentiviral de acordo com o protocolo do fabricante. É importante que todos os procedimentos lentivirais sejam realizados seguindo rigorosamente os requisitos de segurança.
- Semeie 15 x 106 HEK293FT células no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) e incube as células durante a noite a 37 ° C em um prato de 150 mm dentro de uma incubadora umidificada de dióxido de carbono a 5% (CO2).
- Prepare dois tubos de 15 mL com complexo de transfecção. O primeiro tubo contém DNA de plasmídeo de vetor lentiviral (5 μg) e mistura de embalagem lentiviral (22,5 μg) em 2,5 mL de solução de diluição de transfecção. O segundo tubo contém 82,5 μL de reagente de transfecção em 2,5 mL de solução de diluição de transfecção (consulte a Tabela de Materiais).
- Pipetar o conteúdo do tubo 1 no tubo 2 e incubar a mistura em temperatura ambiente por 15 min.
- Transferir o conteúdo do tubo gota a gota para a placa de células HEK293FT e incubar a amostra durante a noite a 37 °C numa incubadora de CO2 humidificada com dióxido de carbono a 5%.
- No dia seguinte, substitua o meio existente por 19 mL de meio de cultura DMEM fresco e continue a incubar as células durante a noite dentro da incubadora umidificada de CO5 2 a 37 ° C.
- Transfira o meio do prato para um tubo de centrifugação de 50 ml. Mantenha o tubo com o meio contendo vírus na geladeira.
- Repita o procedimento acima, adicionando DMEM novo e coletando-o novamente após 1 dia.
- Combine duas coleções do meio em um tubo de centrífuga. Centrifugar o tubo a 2.000 x g durante 30 min a 4 °C.
- Transfira a maior parte do sobrenadante contendo lentivírus para um tubo de centrífuga ultraclear. Deixe um volume mínimo, cerca de 1 mL do sobrenadante para evitar perturbar o pellet, que pode conter células e/ou detritos.
- Ultracentrifugar o sobrenadante acima clarificado a 110.000 x g durante 100 min a 4 °C.
- Remova o sobrenadante com cuidado e adicione suavemente 100 μL de meio DMEM ao pellet de vírus no fundo do tubo. Deixe o tubo no gelo por 15 min. Misturar a solução suavemente e alíquota da solução de lentivírus em tubos estéreis pré-arrefecidos. Armazene esses tubos de estoque de vírus em um freezer a -80 °C.
- Use um kit quantitativo de RT-PCR para determinar o título do lentivírus de acordo com o protocolo do fabricante, que extrai e mede o RNA lentiviral.
2. Geração e expansão de células T CAR
- Ativar células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) previamente congeladas (cerca de 1 x 106 a 2 x 106 células) em 1 mL de meio de células T CAR com um número igual de microesferas revestidas com CD3/CD28 (ver Tabela de Materiais) e incubar as células a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO5 2 por 24 h.
- Descongele uma alíquota do estoque de lentivírus no gelo.
- Adicione 1 μL de agente de transdução no poço com as células e misture.
- Adicione lentivírus às células em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5: 1 e misture suavemente. No dia seguinte, repita esta etapa (24 horas após a primeira transdução).
- Monitore o crescimento das células T a cada 2-3 dias. Adicione mais meio de células T CAR fresco para manter as células em uma densidade de 1 x 106 a 2 x 106 células/mL.
- Congele as células T CAR com um protocolo padrão usando uma solução de congelamento (consulte a Tabela de Materiais).
- Descongele as células T CAR usando um método padrão e pré-cultive-as no meio de células T CAR por cerca de ~ 2-4 h com interleucina-2, IL-2 (300 unidades / mL) antes de aplicá-las ao ensaio.
3. Detecção da expressão de CAR por citometria de fluxo
- Transfira 3 x 105 células T CAR e células T não transduzidas para dois tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mL.
- Centrifugue os tubos a 300 x g por 2 min e ressuspenda as células em 200 μL de tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) contendo 1% de soro humano.
- Pipetar 100 μL de solução celular em dois tubos FACS de poliestireno de 5 mL e manter os tubos no gelo por 5 min.
- Adicionar 1 μL de F(ab')2 de cabra biotinilada a um tubo de cada tipo de célula. Em seguida, adicione 2 μL de ficoeritrina, um anticorpo anti-marcação marcado com PE (consulte a Tabela de Materiais) ao outro tubo de cada tipo de célula. Misture bem e incube-os no gelo por 30 min.
- Lavar as células com 3 ml de tampão FACS em cada tubo e centrifugar os tubos a 300 x g durante 5 min; rejeitar brevemente os sobrenadantes e o vórtice ou agitar brevemente os tubos para ressuspender as células no líquido residual.
- Adicione 2 μL de células apresentadoras de antígeno (APC) anti-CD3 e 2 μL de solução de anticorpo 7-aminoactinomicina D (7-AAD) (consulte a Tabela de Materiais) a cada tubo. No tubo de células coradas com anti-F(ab')2 Ab, adicione 1 μL de estreptavidina marcada com PE. Misture brevemente e incube os tubos no gelo por mais 30 min.
- Use o tampão FACS para lavar as células novamente conforme descrito na etapa 3.5 e adicione mais 200 μL de tampão FACS a cada tubo.
- Use a citometria de fluxo para analisar as células, primeiro controlando as células T em um gráfico de dispersão direta versus dispersão lateral e, em seguida, bloqueando as células vivas (7-AAD-negativo) em um gráfico CD3 vs. 7-AAD. A etapa final é analisar anti-tag, anti-ScFv ou anti-F(ab')2 vs. CD3.
4. Ensaio de potência de citólise em tempo real (RTCA)
NOTA: Realize o ensaio RTCA de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante. Em resumo, primeiro coloque as células-alvo nos poços da placa E, seguida pela adição de células CAR T no dia seguinte. A atividade de citólise das células T CAR contra as células-alvo é monitorada em tempo real. Células T e células T transduzidas simuladas (células T CAR simuladas) são usadas como controles de células efetoras negativas. O protocolo a seguir descreve um ensaio de potência de citólise in vitro em tempo real para linhagens de células tumorais aderentes.
- Adicione 100 μL de meio de cultura de células-alvo a cada poço da placa E xCELLigence, coloque a placa dentro do instrumento xCELLigence e faça uma leitura de fundo. Em seguida, transfira a placa E para uma capa de cultura de tecidos para semeadura celular.
- Use um protocolo padrão para tripsinizar as células-alvo cancerígenas do dispositivo de cultura. Em seguida, transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mL e adicione meio de cultura fresco, até 15 mL. Pulverize as células por centrifugação por 5 min a 200 x g. Descarte o sobrenadante, adicione 5 mL de meio fresco e use uma pipeta sorológica para ressuspender suavemente o pellet celular. Conte a densidade de células vivas usando um hemocitômetro e um microscópio.
- Ajuste a densidade da célula adequadamente e, em seguida, adicione 100 L da suspensão da célula a cada poço da placa E. O número de células-alvo é tipicamente em torno de 10.000 células/poço para linhagens celulares aderentes (BxPC3, Hela-CD19 e SKOV3), ou 30.000 células/poço para células em suspensão, como Raji (veja abaixo detalhes sobre poços de pré-revestimento com anticorpos para amarrar células cancerígenas líquidas).
- Equilibre a placa E à temperatura ambiente por 30 min para permitir que as células se assentem uniformemente no fundo do poço (isso é crítico; não pule esta etapa).
- Coloque a placa E no instrumento xCELLigence dentro da incubadora de cultura de células e comece a medir a impedância, exibida como Cell Index vs. tempo, automaticamente a cada 15 min.
- No dia seguinte, prepare as células T CAR efetoras. Certifique-se de preparar os controles apropriados (ou seja, células T CAR simuladas, células T de controle não transduzidas e/ou células T CAR não relacionadas) com antecedência para garantir que todas as células estejam prontas ao mesmo tempo. Ajuste as células efetoras e as células de controle para a densidade adequada e prepare diluições em série para garantir que as proporções E:T desejadas sejam alcançadas quando 100 μL de suspensão de células efetoras forem adicionadas a cada poço na etapa 9.
- Pause a aquisição de dados do xCELLigence e traga a placa E da incubadora para uma capela de cultura de células.
- Remova 100 μL de meio de cada poço. A quantidade de meio residual em cada poço é agora de 100 μL.
- Adicione 100 μL de células T CAR efetoras diluídas em série ou outras células de controle (ou seja, células T CAR simuladas) para atingir as proporções E:T desejadas.
- Equilibre a placa E à temperatura ambiente por 30 min para permitir que as células efetoras se assentem e, em seguida, coloque a placa E de volta no instrumento xCELLigence. Retomar a aquisição de dados.
- Se assim o desejar, em momentos-chave, a aquisição de dados xCELLigence pode ser pausada e a placa removida para coletar pequenas amostras a serem analisadas por ensaios ortogonais (ou seja, medir a produção de citocinas por ensaio imunoenzimático (ELISA) ou citometria de fluxo).
- No experimento de células T CAR EGFR-GITR-CD3, meça o rendimento do interferon-gama (IFNγ) com um kit ELISA (siga as instruções do fabricante; consulte a Tabela de Materiais).
nota EM RELAÇÃO AO USO DE CÂNCERES LÍQUIDOS: Para testar células cancerígenas hematológicas não aderentes, antes de adicionar células, os poços da placa E são primeiro revestidos com um anticorpo específico para um antígeno que é expresso na superfície das células cancerígenas. Para a linhagem celular Raji B, é usado um reagente de amarração baseado em anti-CD40 (consulte o kit de ensaio de eliminação de tumor líquido na Tabela de Materiais). Abaixo está o procedimento para revestir a placa:
- Diluir o reagente de ligação (anti-CD40) com tampão de ligação até uma concentração de 4 μg/ml.
- Trabalhando dentro de uma capa de cultura de tecidos, adicione 50 μL do reagente de amarração diluído a cada poço da placa E. Deixe a placa E em temperatura ambiente ou em uma incubadora a 37 °C por 3 h.
- Remova o reagente de amarração e lave a placa E pelo menos 2x com tampão de lavagem. Neste ponto, a placa E está pronta para semear as células-alvo Raji (30.000 células/poço).
- Continue com a etapa 4.1 (acima) para executar o restante do procedimento.
