Um método in vitro para determinar a atividade antiapoptótica de anticorpos contra TNFα

Resumo

Fonte: Tierrablanca-Sánchez, L., et al. Determinação da potência relativa de um anticorpo monoclonal anti-TNF (mAb) por neutralização do TNF usando um método bioanalítico in vitro. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra uma técnica para avaliar a eficácia de anticorpos contra o fator de necrose tumoral alfa (TNFα), uma citocina inflamatória, por meio de uma abordagem bioanalítica in vitro. O TNFα, quando introduzido nas células estressadas, desencadeia a apoptose. No entanto, a ligação aos anticorpos limita o TNFα, evitando a apoptose. O grau de apoptose é quantificado usando um ensaio de bioluminescência.

Protocolo

1. Preparação dos meios e soluções

1. Preparar o meio de cultura: RPMI-1640 com 10% de soro fetal bovino (FBS), pH 7,4.
2. Prepare o meio de cultura do ensaio: RPMI-1640 sem vermelho de fenol, mas com 1% de FBS, pH 7,4.
3. Prepare a solução de lavagem celular: solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco sem Mg e Ca com 0,02% de EDTA, pH 7,4.
4. Prepare a solução de descolamento celular: tripsina a 0,125% com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1 mM.
   1. Descongele 100 mL de uma solução de tripsina-EDTA a 0,25% e transfira para um frasco estéril de 500 mL.
   2. Misture com 100 mL de solução de lavagem celular e dispense alíquotas de 15 mL em tubos estéreis de 15 mL. Conservar a -70 a -80 °C até à utilização.
   3. Filtrar estas soluções através de uma membrana de 0,22 μm e aquecer até 37 °C durante pelo menos 30 minutos antes da utilização.
5. Prepare a solução estoque de indução de apoptose Solução TNFα a 3,3 μg / mL.
   1. Dissolva 20 μg de TNFα com 500 μL de água esterilizada por filtro em seu recipiente primário e misture até a dissolução completa.
   2. Transfira para um tubo estéril de 15 mL e adicione 5,5 mL de solução livre de DPBS Mg e Ca a este tubo. Misture delicadamente usando um misturador de vórtice.
   3. Alíquota da solução em porções de 70 μL. Dispense cada alíquota em microtubos de 0,5 mL e armazene a -80 °C.
6. Prepare a solução de indução de apoptose: solução de TNFα a 40 ng/mL.
   1. Descongelar uma alíquota da solução-mãe de indução de apoptose, incubando-a em banho-maria a 25 °C durante 10 min.
   2. Diluir a solução-mãe de indução de apoptose a 40 ng/ml adicionando 61 μL de solução de TNFα a 3,3 μg/ml de solução de TNFα a 4,939 ml de meio de cultura de ensaio num tubo estéril de 15 ml.
   3. Misturar com um misturador de vórtice durante 10 segundos; esta solução deve ser preparada imediatamente antes da utilização.
   4. Aquecer a solução a 37 °C durante, pelo menos, 30 minutos antes da utilização no ensaio de neutralização.
7. Preparar a solução de substrato: solução de caspase 3/7 Glo.
   1. Descongele a solução tampão de caspase (tampão caspase 3/7 Glo) por 12 horas antes de usar.
   2. Deixe a solução tampão de caspase e o substrato (substrato de caspase 3/7 Glo) descansar separadamente a 25 ± 5 °C por 30 min antes de misturar.
   3. Transfira 10 mL da solução tampão de caspase para o frasco de substrato e misture por inversão.
   4. Manter a 25 ± 5 °C, protegido da luz até o uso.
      nota: A solução é estável por 6 h à temperatura ambiente.

2. Cultura e contagem de células

1. Descongelamento celular e a primeira subcultura.
   1. Retire um frasco para injetáveis com células WEHI 164 de um congelador a -80 °C e transfira-os para um banho de gelo.
   2. Pipete para cima e para baixo com 1 mL de meio de cultura pré-aquecido até que as células congeladas descongelem completamente.
   3. Dispense 9 mL de meio de cultura pré-aquecido em um tubo estéril de 15 mL.
   4. Transfira a suspensão celular para o tubo estéril de 15 mL e misture delicadamente cinco vezes por inversão.
   5. Centrifugar a suspensão celular a 125 x g durante 3 min. Rejeitar o sobrenadante e desagregar o sedimento celular.
   6. Adicione 5 mL de meio de cultura ao tubo. Misture até que as células estejam completamente ressuspensas.
   7. Para contagem de células, transfira 50 μL da suspensão celular para um microtubo de 500 μL e misture com 50 μL de azul de tripano a 0,4%. Conte as células e ajuste-as para 0,5 x 10⁶ células/mL. Consulte a etapa 2.2 abaixo.
   8. Adicionar 13 ml de meio de cultura pré-aquecido a um balão de cultura de células de 75 ml.
   9. Dispensar volume de suspensão celular suficiente da etapa 2.1.6 para atingir 0,5 x 10⁶ células/ml no balão de cultura de células e incubar a 37 °C e 5% de CO₂ durante a noite.
2. Contagem de células.
   1. Usando a solução da etapa 2.1.6, transfira 0,05 mL para um hemocitômetro e determine a densidade celular ao microscópio usando a exclusão de azul de tripano.
   2. Quantifique o número total de células e células viáveis.
   3. Ajuste as suspensões celulares para 0,5 x 10⁶ células/mL.
      V_{meio de cultura} (mL) =
      _{Meio de cultura} V (mL) = (5mL -_{suspensão de células} V)
      _{Meio de cultura} V (mL) = Volume ajustado da suspensão celular WEHI 164
      CNV = Número de HVECs viáveis 164 células/mL
      _{Meio de cultura} V (mL) = Volume do meio de cultura de ensaio adicionado à suspensão celular para atingir 0,5 x 10⁶ células/mL
      0,5 x 10⁶ = Densidade de células alvo
3. Descolamento celular e segunda e terceira subculturas.
   nota: Um sistema de vácuo pode ser usado para remover as soluções dos frascos. Pipetas descartáveis ou estéreis de vidro podem ser usadas. Se a pipeta tiver um entupimento de algodão na parte superior, ele deve ser removido antes do uso.
   1. Remover o meio de cultura do balão T de cultura de células utilizando uma pipeta estéril de 1 ml e um vácuo.
   2. Dispense 5 ml de solução de lavagem celular no balão T de cultura, misture delicadamente e elimine a solução. Repita esta etapa duas vezes.
      nota: A remoção completa do meio de cultura é fundamental para o descolamento celular eficiente.
   3. Adicionar 15 ml de solução de descolamento de células ao balão T e repousar durante 3 minutos numa incubadora a 37 °C e 5% de CO₂.
   4. Verificar a ausência de células fixas na parede interna do balão ao microscópio. Remover as células do balão T de cultura utilizando uma pipeta estéril de 20 ml e dispensá-las num tubo estéril de 50 ml.
   5. Centrifugar a suspensão celular a 125 x g durante 3 min. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com mais 5 ml de meio de cultura.
   6. Conte as células e adicione meio de cultura suficiente para atingir a concentração celular desejada de acordo com a Equação 1.
   7. Adicionar esta suspensão a um balão em T de 72 cm² e incubar durante a noite a 37 °C e 5% de CO₂.
   8. Subcultive as células pelo menos duas vezes antes de usá-las no ensaio de neutralização. Repita as etapas 2.3.1-2.3.8 nos próximos dois dias.
4. Suspensão de células de ensaio.
   1. Selecione uma subcultura WEHI 164 que tenha pelo menos três passes. Consulte a etapa 2.1.
   2. Retire e conte as células de acordo com as etapas 2.2 e 2.3 deste protocolo.
   3. Diluir a suspensão celular de acordo com a Equação 1 a 0,5 x 10⁶ células/ml.
   4. Use esta suspensão celular para o ensaio de neutralização. Misture todas as suspensões de células com um misturador de vórtice antes de usar.

3. Preparação e diluições de anticorpos

1. Quantificação dos mAbs.
   1. Determinar a concentração da substância de referência, da amostra de controlo e da amostra analítica por absorção de UV a 280 nm, utilizando o seu coeficiente de extinção em massa (1,39).
      nota: As concentrações originais podem ser retiradas dos rótulos dos medicamentos. No entanto, isso deve ser verificado por absorção de UV.
2. diluições de mAb.
   1. Diluir todas as amostras independentemente em triplicado, com solução livre de DPBS Mg e Ca em microtubos de 2 mL, até 2 mg/mL. Confirmar esta concentração por absorção de UV em triplicata, utilizando como branco a solução isenta de DPBS Mg e Ca.
   2. Misture as soluções de proteína de estoque por 5 segundos usando um misturador de vórtice.
   3. Diluir 100 μL de cada solução de mAb de 2 mg/ml com 0,9 ml do meio de cultura de ensaio.
   4. Misture por 5 s com um misturador de vórtice.
      nota: Essas soluções têm uma concentração de 200 μg/mL. As diluições devem ser feitas para cada triplicado.
   5. Diluir 10 μL de cada solução de 200 μg/ml de mAb com 0,99 ml do meio de cultura do ensaio. Misture por 5 s usando um misturador de vórtice. Essas soluções têm uma concentração de 2 μg/mL. Realize diluições seriadas para cada triplicado antes de usá-los no ensaio de neutralização.
   6. Faça diluições de mAb anti-TNFα em três microplacas independentes. Faça uma duplicata de cada triplicata independente e dispense-as em uma microplaca, conforme indicado na Tabela 1. Substância de referência
   7. Realizar diluições de mAb de cada referência, amostra ou controle, conforme mostrado na Tabela 2.
      nota: As concentrações de mAb anti-TNFα descritas nesta tabela não são as concentrações finais no ensaio de neutralização.
   8. Mantenha as placas a 25 ± 5 °C até ao uso.

4. Ensaio de neutralização com células WEHI 164

1. Misture por vórtice todas as suspensões celulares (0,5 x 10,⁶ células/mL) antes de dispensar em qualquer etapa deste protocolo.
   nota: Nesta secção, aquecer cada solução a 37 °C durante 30 minutos antes da utilização.
2. Transferir 50 μL da suspensão celular para cada um dos 60 poços das microplacas, passando da coluna 2 para a 11 e da linha B para G.
3. Transfira 50 μL de diluições de referência, amostra e controle de mAb para microplacas. Siga o padrão representado na Figura 1.
4. Adicione 50 μL da solução de indução de apoptose a cada poço.
5. Utilizar controles celulares de 50 μL de células WEHI 164, dispensadas em três poços. Leve cada alvéolo a um volume final de 150 μL com um meio de cultura de ensaio.
6. Use um controle de citotoxicidade de uma mistura de 50 μL de células WEHI 164 mais 50 μL de solução de indução de apoptose. Leve cada alvéolo a um volume final de 150 μL com um meio de cultura de ensaio.
7. Para o controle de TNFα, use 50 μL da solução de indução de apoptose e leve-a a 150 μL com o meio de cultura de ensaio.
8. Para o branco, use 150 μL apenas do meio de cultura do ensaio.
9. Encha os alvéolos restantes com 150 μL de meio de cultura para evitar os efeitos de evaporação da placa.
10. Repita as etapas 4.1.1-4.1.9 duas vezes em duas outras microplacas.
    nota: As concentrações finais de mAb na microplaca são: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 e 0,004 μg/mL.
11. Carregar as amostras em microplacas, conforme indicado na figura 1
12. Incubar as três placas a 37 °C e 5% de CO₂ durante 16 ± 2 h.
13. Deixe o reagente caspase 3/7 Glo repousar a 25 ± 5 °C por 30 min antes de usar.
14. Adicione 100 μL deste reagente a todos os poços, incluindo as amostras e controles.
15. Agite as placas usando um misturador de vórtice de microplacas por 3 min a 25 ± 5 °C imediatamente após a distribuição nos poços.
16. Incubar as placas durante 2,5 ± 0,5 h a 25 ± 5 °C, protegidas da luz.
17. Insira as microplacas no luminômetro e complete a próxima seção.

5. Análise dos resultados

1. Usando o software para detecção de luminescência, selecione o modo de luminescência e a função de ponto final.
2. Selecione uma placa de fundo transparente de 96 poços e seus 80 poços internos, excluindo as colunas 1 e 12.
3. Selecione um tempo de integração de 1.250 ms e 10 s para misturar a microplaca antes de ler.
4. Selecione os poços onde a substância de referência, a substância analítica e a amostra de controle serão colocadas e identifique-os com suas concentrações correspondentes.
5. Leia as amostras colocadas nas microplacas com o luminômetro.
6. Use uma equação de quarto parâmetro para as análises dos resultados. Representar graficamente uma curva dose-resposta, conforme ilustrado na Figura 2.
   NOTA: Na equação do quarto parâmetro, C é a concentração efetiva 50 (EC50). Este valor será utilizado para comparar a substância de referência, a amostra analítica e a amostra de controlo por meio da função efetora.
7. Para calcular as potências relativas, fixar a substância de referência em 100%, calcular as potências da amostra e controlar em conformidade.
   nota: Esses valores são representados na Figura 3.

Tabela 1: Matrizes de amostras de microplacas. Um ensaio de neutralização completo deve ser executado em três microplacas dentro das coordenadas B2 a G11. A distribuição aleatória de amostras de referência, analíticas e de controle permite que os pesquisadores verifiquem qualquer viés no ensaio.

Placa 1		Placa 2		Placa 3
Wells	amostra	Wells	amostra	Wells	amostra
B2: B11	Substância de referência	B2: B11	Exemplo de controle	B2: B11	Amostra analítica
C2: C11		C2: C11		C2: C11
D2: D11	Amostra analítica	D2: D11	Substância de referência	D2: D11	Exemplo de controle
E2: E11		E2: E11		E2: E11
F2: F11	Exemplo de controle	F2: F11	Amostra analítica	F2: F11	Substância de referência
G2: G11		G2: G11		G2: G11

Tabela 2: Diluições de mAb anti-TNFα. Diluições seriadas de mAbs anti-TNFα são demonstradas nesta tabela. As concentrações finais descritas nesta tabela não são as concentrações no ensaio, onde os mAbs anti-TNFα foram diluídos por um fator de 3 (diluição de mAb + meio de cultura + suspensão de células). As linhas em negrito representam diluições provenientes das linhas 3, 5, 7, 9 e 10; As linhas sem negrito representam a diluição das linhas 3, 4 e 6. Essas diluições seriadas são feitas imediatamente antes de realizar o ensaio de neutralização. Deve-se ter o cuidado de misturar pipetando para cima e para baixo três vezes antes de dispensar as diluições.

Coluna de placa	Volume do meio de cultura do ensaio (μL)	Volume da substância de referência, amostra analítica ou amostra de controlo (uL)	Concentração na placa de ensaio (ng/mL)
algarismo	0	230	2000
3	150	150 da linha 2	1000
4	75	75 da linha 3	500
5	100	50 da linha 3	333
6	75	75 da linha 4	250
7	75	75 da linha 5	166
8	75	75 da linha 6	125
9	75	75 da linha 7	83
10	75	75 da linha 9	41
11	150	75 da linha 10	13

Resultados

Figura 1: Disposição das amostras nas placas de ensaio. B1 a G11 são coordenadas de poços nas microplacas e descrevem as posições onde as diluições da amostra são colocadas. As coordenadas ausentes são poços preenchidos com controles e meio de cultura de ensaio (A1-A12 e H1-H12). Essa distribuição aleatória de amostras (diluições diretas e reversas nas microplacas) ajuda a eliminar o viés nos resulta...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
WEHI 164	ATCC	CRL-1751	Células de fibrossarcoma de Mus musculus
RPMI-1640 Médio	ATCC	30-2001	Armazenar o meio a 2 °C a 8 °C
RPMI 1640 Médio, sem vermelho de fenol	GIBCO	11835-030	Armazenar o meio a 2 °C a 8 °C
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol	GIBCO	Rolamento 25200-056	Armazene o meio a -10 °C a -20 °C
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	GIBCO	14190-136	Armazenar o meio a 2 °C a 8 °C
Proteína TNF-alfa humana recombinante	Sistemas de P&D	210-TA-020	Armazenar de -20 °C a -70 °C
Soro fetal bovino (EUA), IgG super baixa	HyClone	SH3089803	Armazenar de -10 °C a -20 °C
Soro fetal bovino (EUA), caracterizado	HyClone	SH3007103	Armazenar de -10 °C a -20 °C
Kit de ensaio Caspase-Glo 3/7	Promega	G8093	Conservar o substrato Caspase-Glo. 3/7 e o tampão Caspase-Glo. 3/7 a –20 ºC protegidos da luz
EDTA, sal dissódico, di-hidratado, cristal, reagente ACS	J.T.Baker	8993-01	--
Amostra de mAb Adalimumabe	Probiomed	NA	As concentrações finais na microplaca são: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 e 0,004 μg/mL
Referência e controle mAb Adalimumabe	Abbvie	NA	As concentrações finais na microplaca são: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 e 0,004 μg/mL
Leitor de microplacas	Dispositivos Moleculares	89429-536	SpectraMax M3 Multimodo
Software de leitor de microplacas	Dispositivos Moleculares	--	SoftMax Pro 6.3 GxP
incubadora	Revco	Rolamento 30482	Revco RNW3000TABB CO2 de ar forçado
Capa de fluxo laminar	A Companhia Baker	200256	Padeiro SG603A-HE | Alta eficiência, classe II tipo A2