Um ensaio in vitro baseado em células dendríticas pulsadas por vacina para induzir a proliferação de linfócitos

Resumo

Fonte: Liaqat, F., et al., Determinação da imunogenicidade da vacina usando células dendríticas derivadas de monócitos bovinos. J. Vis. Exp. (195), (2023).

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em MoDC de células dendríticas derivadas de monócitos para medir a imunogenicidade de vacinas disponíveis comercialmente. Os ensaios do MoDC investigam as respostas das células dendríticas a antígenos, patógenos ou tratamentos e podem fornecer informações sobre respostas imunes, desenvolvimento de vacinas e pesquisa de imunoterapia.

Protocolo

1. Produção de MoDCs ingênuos

NOTA: Amostras de sangue total foram obtidas de um único bezerro livre de patógenos por punção da veia jugular com vacutainers heparinizados (oito tubos de sangue de 9 mL foram usados para este estudo). Transporte o sangue em uma caixa de gelo. Armazene as amostras a 2-4 °C para uso posterior ou processe-as imediatamente. Mantenha o sangue girando para evitar a coagulação do sangue. Esterilize os vacutainers com etanol 70%. Todos os experimentos a seguir foram realizados com uma amostra biológica e seis repetições técnicas.

1. Centrifugação com gradiente de densidade p....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Buffer de lise ACK	Gibco, Thermo Fisher	A1049201	Tampão amônio-cloreto-potássio para lise de hemácias residuais na fração PBMC colhida
Kit de Crescimento de Células Dendríticas Bovinas	Bio-Rad, Reino Unido	PBP015KZZ	Coquetel de citocinas composto por IL-4 bovina recombinante e GMCSF
Kit ELISA IFN-γ Bovino	Bio-Rad	MCA5638KZZ	Uso de kit para medir a expressão de IFN-γ em sobrenadante de cultura
Raiva Nobivac	MSD Saúde Animal, Reino Unido		1 μL/mL de vacina inativada cultivada em células contendo> 2 I.U./mL Estirpe do vírus da raiva
Vedações ópticas	Bi0-Rad	TCS0803	0,2 mL de tubo de PCR plano 8 tiras de tampa, ópticas, ultraclaras, compatíveis para máquina de qPCR
Tampão fosfato salino (PBS)	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7,4, concentração de 1x
Tubo FlowTubes/FACS (classificação de célula única ativada por fluorescência)	Falcão Corning	352235	Tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL, estéril com tampa de pressão do filtro de células, uso em análise de citometria de fluxo
Microesferas CD14 humanas	Miltenyi Bioteck, Alemanha	130-050-201	2 mL de microesferas conjugadas ao anticorpo monoclonal anti-CD14 humano isotipo IgG2a, utilizadas para seleção de monócitos bovinos a partir de PBMCs
Anticorpo anti-humano Ki-67 purificado	Biolegend, EUA	350501	Anticorpo monoclonal, reativo cruzado com vaca, clone ki-67
RPMI 1640 Médio	Sigma Aldrich	R8758	Meios de cultura celular com L-glutamina e bicarbonato de sódio
Placa de teste de cultura de tecidos 24	TPP, Suíça	Rolamento 92024	Placa de 24 poços, esterilizada por radiação, tratamento com aumento de crescimento, volume 3,18 mL