1. Produção de MoDCs ingênuos
NOTA: Amostras de sangue total foram obtidas de um único bezerro livre de patógenos por punção da veia jugular com vacutainers heparinizados (oito tubos de sangue de 9 mL foram usados para este estudo). Transporte o sangue em uma caixa de gelo. Armazene as amostras a 2-4 °C para uso posterior ou processe-as imediatamente. Mantenha o sangue girando para evitar a coagulação do sangue. Esterilize os vacutainers com etanol 70%. Todos os experimentos a seguir foram realizados com uma amostra biológica e seis repetições técnicas.
- Centrifugação com gradiente de densidade para isolar PBMCs do sangue heparinizado
- Misture bem o sangue invertendo-o 10x.
- Usando uma pipeta de 10 mL, transfira 20 mL de sangue heparinizado para um tubo estéril de 50 mL e dilua-o com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Pipetar 15 mL de meio de isolamento de linfócitos para um tubo estéril de 50 mL.
nota: Deixe o meio isolante de linfócitos atingir a temperatura ambiente antes da pipetagem.
- Incline o tubo de 50 ml que contém o meio de isolamento de linfócitos para uma posição de 45°. Aponte a ponta de uma pipeta de 25 mL perpendicularmente e coloque cuidadosamente os 30 mL de PBS no sangue sobre o meio de isolamento de linfócitos, sem misturar os dois. Muito lentamente, traga o tubo de 50 mL de volta para a posição vertical.
- Centrifugar a 800 × g durante 35 min a 20 °C com aceleração máxima e sem travagem (função de desaceleração desligada).
- Use uma pipeta de Pasteur para coletar a camada de PBMC (a fina camada branca logo após a primeira camada de plasma) e transfira-a para um novo tubo de 50 mL.
nota: A centrifugação com gradiente de densidade separa o sangue total em diferentes camadas. Como resultado, os eritrócitos se depositam na parte inferior como um pellet, as células mononucleares (PBMCs) se depositam na camada de interface e o plasma forma a camada superior. Os granulócitos são encontrados entre o pellet e a camada de PBMC.
- Lave os PBMCs colhidos 2x adicionando PBS até um volume de 40 mL e misturando bem pipetando para cima e para baixo. Em seguida, centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 7 min com aceleração máxima e desaceleração máxima.
- Descarte o sobrenadante por decantação, ressuspenda o pellet em 15 mL de tampão 1x cloreto de amônio-potássio (ACK) e incube em temperatura ambiente por 10-15 min.
nota: Não incube por mais de 15 minutos. O tampão ACK disponível comercialmente é usado para garantir a lise dos glóbulos vermelhos residuais (RBCs) presentes na fração PBMC.
- Adicionar PBS até um volume de 40 ml e, em seguida, centrifugar a 500 × g e 4 °C durante 7 min com aceleração e desaceleração máximas.
- Rejeitar o sobrenadante por decantação e repetir o passo 1.1.9.
- Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de meio de cultura completo (à temperatura ambiente).
nota: O meio de cultura completo é composto por meio de cultura de células RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina.
- Separação magnética das células CD14+/− da população PBMC usando esferas magnéticas conjugadas com CD14
- Conte as células com um contador de células de hemocitômetro limpo usando 10 μL de suspensão celular misturada com 10 μL de solução de azul de tripano (0,4%).
NOTA: O corante azul de tripano é um produto químico tóxico e potencialmente cancerígeno. Deve ser manuseado com o uso de equipamento de proteção individual (EPI) para evitar o contato, e os resíduos devem ser descartados em um recipiente hermético especializado para resíduos tóxicos. As células mortas aparecerão azuis, enquanto as células vivas aparecerão claras ao microscópio.
- Centrifugue por 7 min a 500 × g.
- Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender o sedimento em tampão de classificação de células activado por fluorescência (FACS) utilizando um volume de 40 μL por cada 1 × 107 células. Misture bem usando uma pipeta.
NOTA: O tampão FACS é composto por 2% de FBS e 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) dissolvido em PBS.
- Adicione 5 μL de tampão de microesferas CD14 por 1 × 107 células e misture bem usando uma pipeta.
- Incubar durante 30 min a 4-8 °C para a seleção positiva de monócitos CD14+ bovinos. Vórtice a cada 15 min durante o período de incubação.
- Etapa opcional (para análise por citometria de fluxo): Adicionar 10 μL de anticorpo de coloração CD14-FITC (isotiocianato de fluoresceína) com incubação subsequente por 15 min a 4-8 °C. Consulte a análise de citometria de fluxo na etapa 5 para obter detalhes.
- Adicione 1 mL de tampão FACS e centrifugue por 7 min a 500 × g.
- Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 μL de tampão FACS por 1 × 108 células.
- Insira a coluna de separação de células imunomagnéticas no separador (suporte da coluna magnética) e coloque um tubo de coleta de 15 mL sob a saída da coluna para coletar o fluxo.
- Lave a coluna com 1 mL de tampão FACS desgaseificado. Após o enxágue, substitua o tubo de 15 mL usado por um novo.
- Permitir que a suspensão celular (do passo 1.2.8) passe pela coluna pipetando 1 × 108 células em 500 μL de tampão por vez.
nota: Preste atenção para não gerar bolhas de ar ao misturar as células antes de permitir que elas passem pela coluna.
- Enxágue a coluna 3x com 3 mL de tampão FACS desgaseificado de cada vez.
- Colete o fluxo e rotule essa primeira fração eluída como a fração de células CD14− (PBMCs menos monócitos CD14+); isso também é chamado de fração de linfócitos ingênuos.
nota: As células CD14− são mantidas em um meio de cultura completo até que MoDCs pulsadas por antígeno sejam produzidas.
- Remova a coluna do separador.
- Coloque um novo tubo estéril de 15 mL sob a coluna para a coleta do efluente.
- Pipete 5 mL de tampão FACS na coluna e empurre-o imediatamente usando um êmbolo.
- Colete o fluxo e rotule essa segunda fração eluída como a fração de células CD14 +; isso também é chamado de fração de monócitos ingênuos.
- Adicionar meio de cultura completo aos monócitos CD14+ colhidos para atingir 1 × 106 células/mL.
nota: Contar as células vivas na fracção de células CD14+ eluída para estimar o volume do meio de cultura completo necessário para atingir a contagem de células desejada.
- Pegue uma placa estéril de 24 poços e adicione 1 mL da suspensão celular (1 × 106 células / mL) a cada poço.
- Diferenciação dos monócitos CD14+ virgens em MoDCs virgens pela adição de coquetel de citocinas a 3% p/v (GM-CSF + IL-4) com um total de 5 dias de incubação
- Suplementar cada alvéolo contendo monócitos CD14+ com 40 μL (3% p/v) do coquetel de citocinas fornecido no kit.
- Incubar a placa numa incubadora humidificada com 5% de CO2 e a 37 °C durante 48 h.
- No dia 2, transfira metade do conteúdo de cada poço (500 μL) usando uma pipeta para tubos individuais de 1,5 mL e centrifugue a 500 × g a 4 ° C por 7 min.
- Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 μl de meio de cultura completo fresco.
- Transfira 500 μL desta suspensão celular da etapa 1.3.4 de volta para cada poço designado, de modo que o volume final seja de 1 mL.
- Enriqueça cada poço com 20 μL de coquetel de citocinas.
- Incubar a cultura durante 72 h numa incubadora humidificada com 5% de CO2 e a 37 °C.
- Após a incubação no dia 5, retire a placa da incubadora.
NOTA: Cada poço conterá 1 mL de uma suspensão celular de MoDCs ingênuos. O número de MoDCs será uma porcentagem (~ 20%) dos monócitos originais plaqueados (1 × 106 / mL).
2. Geração de MoDCs pulsados por antígenos
NOTA: Uma vacina comercialmente disponível e clinicamente aprovada contra o vírus da raiva (RV) pode induzir a diferenciação de MoDCs virgens em MoDCs apresentadores de antígenos maduros. Use 0,1% (~ 1 μL) de uma única dose de vacinação RV para gerar MoDCs pulsados por antígeno. Além disso, é preferível produzir MoDCs pulsados por RV na mesma placa de cultura usada para gerar MoDCs ingênuos, porque a transferência dos MoDCs ingênuos para uma nova placa de 24 poços os afetará negativamente.
- Adicione 1 μL / mL de suspensão RV a 1 mL de cultura MoDC ingênua na placa de 24 poços e incube por 48 h a 5% de CO2 e 37 ° C.
NOTA: MoDCs virgens cultivados sem estimulação de RV são usados como controle de fundo (e como estimulação não específica para co-cultura com linfócitos nas próximas etapas).
- Após a incubação, no dia 7, mantenha a placa de 24 poços contendo os MoDCs pulsados de antígeno em gelo por 10 min.
- Adicione 1 mL de PBS gelado por poço. Misture bem cada poço pipetando e transfira a suspensão para um tubo de 15 mL.
- Lave os poços com 2 mL de PBS gelado para coletar as células residuais deixadas dentro de cada poço.
- Transfira o conteúdo para seus respectivos tubos e centrifugue a suspensão celular a 500 × g por 7 min.
- Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento celular (MoDCs pulsados pelo antigénio) num meio de cultura completo e ajustar o volume para uma concentração celular final de 1 × 105 células/ml.
nota: Conte as células vivas para estimar o volume de meio necessário para atingir a contagem de células desejada. Use MoDCs pulsados em RV a partir do dia 7 para o sistema de co-cultura de linfócitos MoDC.
3. Co-cultura de linfócitos MoDC
NOTA: O sistema de co-cultura de linfócitos MoDC in vitro determina a capacidade dos MoDCs de preparar linfócitos específicos do antígeno. Os diferentes grupos de tratamento de células após 16 dias de co-cultura incluem específico, inespecífico e controle. O grupo específico é definido como linfócitos co-cultivados com MoDCs pulsados em RV; o grupo inespecífico é definido como linfócitos co-cultivados com MoDCs não pulsados por antígeno; e o grupo controle é definido como linfócitos cultivados sem MoDCs.
- Adicionar meio de cultura completo à fração de linfócitos naive eluída (células CD14−) para atingir uma concentração celular de 2 × 106 células/mL.
NOTA: Conte as células vivas na cultura de células CD14− que foram mantidas em meio de cultura completo em uma placa de 24 poços desde sua coleta para estimar o volume de meio necessário para atingir a contagem de células desejada.
- No dia 7, pegue uma placa estéril de 24 poços e semeie os poços com 1 mL de suspensão de células linfocitárias virgens (2 × 106 células/mL) mais 1 mL de suspensão MoDC pulsada ou não pulsada por antígeno (1 × 105 células/mL).
nota: O volume total em cada poço será de 2 mL com uma proporção de 1:20 MoDCs para linfócitos por poço.
- Incubar a placa durante 48 h a 37 °C e 5% de CO2.
- Enriquecimento e reestimulação de cultura com MoDCs pulsados por antígeno
- Após a incubação da cocultura de linfócitos MoDC pulsada com antígeno, no dia 9, suplemente cada poço com 20 ng/mL de IL-2 recombinante e continue a incubar por mais 120 h (5 dias de incubação).
- No dia 14, transfira 1 mL da co-cultura para um tubo estéril de 1,5 mL e centrifugue a 500 × g por 7 min.
- Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular com 1 mL de MoDCs pulsados ou não pulsados por antígeno (1 × 105 células / mL). Misture delicadamente pipetagem e transfira as suspensões de células de volta para seus poços designados.
nota: Nesta etapa, o volume total em cada poço é de 2 mL.
- Continue com a incubação a 5% de CO2 e 37 °C por 48 h. Após a incubação no dia 16, a co-cultura está pronta para análise usando citometria de fluxo, qPCR e ELISA.
nota: Para cada 2 mL em cada poço da co-cultura de linfócitos MoDC, 1 mL de células ressuspensas é corado para citometria de fluxo, 1 mL é usado para extração de RNA e os sobrenadantes de ambos são usados para ELISA.
4. Análise por citometria de fluxo
NOTA: Manchar as células com marcadores/mAb apropriados antes de executar as amostras em um citômetro de fluxo. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os reagentes (mAb de coloração e controles de isotipo), kit, instrumento e software usados para a análise de citometria de fluxo.
- Protocolo de coloração por citômetro de fluxo
nota: Realize a coloração da superfície celular para os PBMCs e linfócitos e monócitos virgens usando mAb anti-CD14 (etapa 1.2.6). Para a coloração da superfície celular de MoDCs virgens, use mAb anti-CD86, anti-CD40 e anti-MHC II. Para a coloração da superfície celular de células de co-culturas do dia 16, use mAbs anti-CD4, anti-CD8 e anti-CD25; para coloração intracelular, use mAb anti-Ki-67. Além disso, corar as células com mAb de controle de isotipo negativo ou sem mAb (FMO: fluorescente menos um). A principal diferença ao marcar marcadores de superfície e intracelulares é que, para marcadores de superfície celular, as células devem ser coradas com mAb de superfície específico antes da coloração viva/morta (L/D) ou qualquer outro processo. No entanto, a coloração intracelular é realizada após a coloração L/D e requer uma etapa de fixação mais permeabilização para permitir a penetração intracelular.
- Transferir 1 mL de suspensão celular para um tubo estéril de 1,5 mL usando uma pipeta e centrifugar por 10 min a 500 × g.
NOTA: Após a centrifugação, ao processar as células da co-cultura de linfócitos MoDC, guarde o sobrenadante para análise ELISA.
- Ressuspenda o pellet em 1 mL de PBS e transfira-o para um tubo de 15 mL. Colete as células residuais usando 1 mL de PBS e combine-o com o pellet ressuspenso.
- Adicione 10 mL de PBS ao tubo de 15 mL que contém as células, misture por pipetagem e centrifugue por 7 min a 850 x g.
- Rejeitar o sobrenadante e repetir o passo 4.1.3.
- Rejeitar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento celular com a suspensão residual (cerca de 180 μl) deixada após a decantação do sobrenadante.
- Transfira a suspensão da célula para uma placa de 96 poços com fundo em V e sele os poços para evitar derramamento.
- Centrifugue a placa a 1.400 × g por 5 min. Após a centrifugação, passe a placa sobre um recipiente de resíduos para esvaziar os poços de líquido e bata a placa no papel absorvente para garantir a remoção do excesso de líquido.
- Adicione 25 μL de mistura mestre de coloração superficial por poço e misture suavemente usando uma pipeta, seguida de incubação a 4 ° C por 30 min.
nota: Para preparar a mistura mestre de coloração de superfície para um único poço, adicione 2,5 μL de mAb de superfície a 20 μL de tampão FACS.
- Adicione 200 μL de tampão FACS por poço e centrifugue a 1.400 × g por 5 min. Após a centrifugação, esvazie os poços de líquido por decantação e bata a placa no papel absorvente para remover o excesso de líquido.
- Adicione 100 μL de solução de coloração L/D por poço. Misture bem usando uma pipeta, seguida de incubação a 4 ° C por 15 min no escuro.
nota: Para um único poço, dissolva 0,25 μL de corante L/D em 100 μL de tampão FACS. O corante L/D ajuda a distinguir entre células vivas e mortas.
- Adicione 100 μL de tampão FACS. Cubra os poços com a tampa e centrifugue a placa por 1.400 × g por 5 min. Rejeitar o sobrenadante por decantação e bater a placa em papel absorvente.
- Repita a etapa 4.1.11.
- Adicione 50 μL de solução de fixação por poço (fornecido com o kit) e misture com uma pipeta antes de incubar a placa em temperatura ambiente no escuro por 10 min.
- Adicione 150 μL do tampão de permeabilização-lavagem (PW) 1x fornecido com o kit e cubra os poços com a tampa.
nota: Para preparar 10 mL de tampão 1x PW, dilua 1 mL de tampão permanente 10x em 10 mL de dH2O.
- Centrifugar a placa a 1.400 × g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante por decantação e bater a placa em papel absorvente.
- Adicionar 200 μL de 1x PW, seguido de centrifugação a 1.400 × g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante por decantação e bater a placa em papel absorvente.
- Para coloração intracelular, adicione 25 μL de mistura mestre de coloração intracelular (anti-Ki-67 mAb humano) por poço. Misture bem e incube a placa por 30 min a 4 °C ou no gelo no escuro.
nota: Para preparar a mistura principal de coloração intracelular para um único poço, adicione 1 μL de Ki-67 mAb a 24 μL de 1x PW. O marcador de coloração intracelular é usado apenas no processamento de células da cocultura do dia 16. A coloração intracelular não é feita durante o processamento de PBMCs, linfócitos virgens, monócitos e MoDCs ingênuos.
- Após a incubação, adicione 200 μL de 1x PW a cada poço. Misture com uma pipeta e centrifugue por 1.400 × g por 5 min. Rejeitar o sobrenadante por decantação e bater a placa em papel absorvente.
- Adicionar 200 μL de tampão FACS, seguido de centrifugação a 1.400 × g durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante por decantação e bater a placa em papel absorvente.
- Ressuspenda o pellet celular em 200 μL de tampão FACS e transfira o conteúdo de cada poço para tubos de citômetro de fluxo estéreis separados. Use 300 μL de tampão FACS por poço para coletar as células residuais. As células agora estão prontas para análise de citometria de fluxo.
- Execução da amostra em um citômetro de fluxo
nota: As amostras foram executadas em um citômetro de fluxo (usando lasers de 488 nm, 638 nm e 405 nm) de acordo com o manual do fabricante. Consulte o manual para obter detalhes, solução de problemas e personalização do protocolo.
- Realize procedimentos de limpeza de rotina antes e depois da leitura das amostras.
nota: Não pule uma posição enquanto carrega os tubos no instrumento.
- Para o ciclo de limpeza, use um total de quatro tubos, com o primeiro tubo contendo reagente de limpeza de fluxo e os três tubos restantes contendo dH2O; cada tubo terá 3 mL. Durante a execução da limpeza, adquira dados com uma vazão média por aproximadamente 1 min, capturando 100.000 eventos por tubo abaixo de 330 V para dispersão direta (FSC) contra 265 V para dispersão lateral (SSC).
nota: Nenhum detrito ou evento celular deve ser relatado durante a limpeza; Se isso acontecer, execute a etapa de limpeza novamente. Para executar as amostras, certifique-se de que todas as amostras estejam em uma suspensão homogênea antes de adquirir os dados, pois isso garante uma leitura precisa.
- Para conectar e ligar o citômetro, clique no botão Aplicativo localizado no canto esquerdo da barra de título. No menu suspenso do aplicativo, selecione a opção Citometria e clique na opção Ligar.
nota: No menu suspenso do aplicativo, a opção Abrir permite que os usuários naveguem pelos ensaios pré-programados, enquanto a opção Novo Protocolo permite que os usuários criem novos protocolos.
- Carregar inicialmente a amostra de controlo negativo no suporte multitubos. Selecione Novo Protocolo e observe a lista de trabalho no lado esquerdo da área de trabalho/tela.
- Na lista de trabalho, defina a posição da amostra no suporte multitubo e dê um nome à amostra e ao protocolo de identificação.
- No Painel de Hardware localizado no lado esquerdo da área de trabalho, ajuste e selecione vários parâmetros, como os detectores (FSC, SSC e 10 faixas de fluorescência), as tensões (V) e os ganhos dos fotomultiplicadores e a área-altura-largura (AHW) do sinal.
nota: As seguintes configurações para os detectores foram selecionadas com base no experimento e no instrumento utilizado: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8 / FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
- No Painel de Controle de Aquisição de Instrumentos localizado na barra de título, ajuste as opções de vazão (médio), Tempo (5 min) e Eventos (consulte a etapa 5.2.8) que desejam detectar. Clique na opção Adquirir Único para permitir que o instrumento desenhe/execute a amostra e mostre a visualização em tempo real dos eventos detectados.
- Na visualização em tempo real, ajuste o limite de fluorescência (tensão e ganho) e o tamanho da célula para eventualmente desenhar portas ao redor da população de células desejada, excluindo quaisquer detritos celulares.
nota: O FSC ajuda a distinguir as células com base no tamanho, permitindo assim que os usuários diferenciem entre células do sistema imunológico, como monócitos e linfócitos; os monócitos são maiores e apresentam maior intensidade de FSC em comparação com os linfócitos.
- Adquira aproximadamente um total de 5.000 MoDCs vivos, 50.000 linfócitos vivos e 50.000 eventos de monócitos vivos.
- Uma vez que todos os parâmetros estejam ajustados em referência à amostra de controle negativo, clique em Parar e salve o protocolo.
- Agora carregue todas as amostras no carregador multitubo. Defina cada amostra na lista de trabalho e aplique os parâmetros ajustados em referência ao controle negativo a todas as amostras do experimento. Clique na opção Adquirir para permitir que todas as amostras do experimento sejam executadas consecutivamente.
- Uma vez adquiridos os dados de todas as amostras, salve e transforme em dados legíveis usando um software de análise de dados apropriado que permita a geração de histogramas sequenciais biparamétricos e monoparamétricos.
