Um ensaio de distúrbio de hemócitos para avaliar a readesão de hemócitos a bolsas hematopoiéticas

Resumo

Fonte: Petraki, S. et al., Ensaio de populações de células sanguíneas da larva de Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp.(2015)

Este vídeo demonstra o ensaio de distúrbio de hemócitos, avaliando a readesão de hemócitos nas bolsas hematopoiéticas de larvas de Drosophila. O distúrbio mecânico libera hemócitos residentes, elevando a contagem de hemócitos circulantes. Após a recuperação, a readesão dos hemócitos residentes é confirmada, ilustrando a reversibilidade.

Protocolo

1. Ensaio de sangramento/raspagem de hemócitos

1. Preparação de slides:
   1. Opção 1 para microscópios sem função de varredura de ladrilhos: Para cada larva a ser analisada, prepare uma lâmina de vidro com cerca de 5 poços de Papanicolau de 2 mm quadrados cada, correspondendo à área de visualização de campo do microscópio; adicione aproximadamente 5 a 10 μl de meio S2 a cada um (Figura 1A). Mantenha as lâminas em uma câmara úmida para evitar que os poços sequem.
   2. Opção 2 para microscópios com função de varredura de ladrilhos: Para cada larva a ser analisada, prepare uma lâmina de vidro com 3 a 4 poços de Pap-pen de ~ 3 a 4 mm quadrados cada; adicione aproximadamente 15 a 20 μl de meio S2 a cada poço (Figura 1B). Mantenha as lâminas em uma câmara úmida para evitar que os poços sequem.
      nota: O número de poços recomendado acima é suficiente para totais de até 3.000 hemócitos por larva (larvas do final do^2º ínstar, ~ 2,5 - 3 mm de comprimento, transgene marcando a maioria das células sanguíneas larvais). Ao avaliar um número maior de células sanguíneas, mais poços podem ser necessários para evitar a superlotação.
2. Coleta de larvas:
   1. Esguiche água em um frasco de mosca contendo larvas e lave as larvas em uma placa de Petri, ou coloque um pouco de alimento que contenha larvas em uma placa de Petri e dilua com água usando uma garrafa de esguicho.
   2. Retire delicadamente as larvas da placa de Petri usando um pincel e coloque-as na água em uma placa de cavidade ou em uma lâmina em um bloco frio.
      nota: As larvas podem ser mantidas por um tempo limitado na água ou em um bloco frio; Use amostras dentro de 45 minutos ou menos para evitar a morte larval ou efeitos indesejados nos hemócitos.
3. dissecção:
   1. Selecione as larvas sob um microscópio de fluorescência em um bloco de metal frio. Meça os tamanhos e as larvas da imagem, se desejar.
   2. Isolamento de hemócitos circulantes ("Sangramento"):
      1. Uma vez que as larvas são selecionadas, coloque uma larva no primeiro poço de Papanicolau (Figura 1C, 2A).
      2. Use 2 agulhas limpas ou tesouras de dissecação e fórceps para fazer uma incisão nas extremidades posterior e anterior da larva. Para evitar perturbar os hemócitos residentes, é melhor fazer essas incisões no lado ventral da larva. Para resultados consistentes, faça as incisões nos mesmos locais para cada larva. Para larvas de^1º ínstar, 1 incisão (no ventral anterior) é suficiente.
      3. Deixe a larva sangrar por alguns segundos sem qualquer pressão ou agitação física (Figura 2A).
         nota: Se estiver trabalhando em várias larvas, é melhor fazer essas incisões para cada uma antes de prosseguir para a próxima etapa para evitar manter as larvas no gelo por muito tempo, o que pode afetar a integridade das amostras.
      4. Levante suavemente a larva com as agulhas ou pinças e mergulhe-a no segundo poço para enxaguar os hemócitos circulantes restantes. Depois disso, siga com a liberação dos hemócitos residentes.
   3. Isolamento de hemócitos residentes ("Scrape"):
      1. Transfira suavemente a larva para o próximo poço (Figura 2C).
      2. Identifique a glândula linfática da larva, que normalmente está localizada a aproximadamente 1/3 da extremidade anterior da larva e que pode fluorescer dorsalmente através da parede do corpo larval. Evite a glândula linfática enquanto libera hemócitos residentes, prendendo a larva com uma agulha o mais próximo possível da glândula linfática para evitar perfurações (Figura 2C).
         nota: Durante o desenvolvimento normal, a maturação dos hemócitos das glândulas linfáticas é retardada em comparação com os hemócitos larvais, e os repórteres fluorescentes de hemócitos diferenciados podem não mostrar sinal nas glândulas linfáticas das larvas jovens. Nesses casos, menos atenção precisa ser dada à glândula linfática, pois não é esperada contaminação de hemócitos larvais marcados com fluorescência diferenciados por hemócitos de glândulas linfáticas.
      3. Libere células sanguíneas residentes em um processo de dissecação de raspagem e/ou espetação. Use uma ponta de agulha para fixar efetivamente a larva perto da glândula linfática (veja acima) ou outras áreas do corpo, conforme necessário. Use outra agulha para espetar os aglomerados de hemócitos que são visíveis através da parede do corpo larval (Figura 2C, E), com o objetivo de separar os hemócitos. Os hemócitos também podem ser liberados em um movimento de raspagem. No entanto, rasgar a epiderme precocemente pode liberar grandes aglomerados de células sanguíneas, o que pode tornar a contagem automatizada mais desafiadora.
         nota: Dependendo da idade e do genótipo da larva, o número de hemócitos totais varia. Distribua o processo de liberação descrito acima em vários poços para evitar a superlotação de alguns poços com células sanguíneas, o que poderia dificultar a análise de imagens de células únicas.
      4. Se restarem poucos hemócitos na carcaça final, conte-os por observação ao microscópio e uso de um contador manual (Figura 2E). Para facilitar a contagem, coloque a carcaça em uma área limpa da mesma lâmina e espalhe-a o mais fino possível para reduzir o número de planos ópticos.
      5. Quando a dissecção estiver concluída, aguarde entre 5 a 10 minutos para que as células se assentem (mas não necessariamente adiram) antes de obter imagens dos poços. Incube a lâmina em uma câmara úmida para evitar a secagem e evite o manuseio brusco das lâminas, o que pode perturbar os hemócitos sedimentados.
         nota: Ao determinar a contagem de hemócitos, as células liberadas não são fixadas e as células devem ser visualizadas logo após a dissecção, de preferência dentro de 30 minutos após a liberação da larva. Dependendo do volume do meio e das propriedades da célula, a grande maioria das células terá se acomodado dentro de 5 a 10 minutos, o que deve ser confirmado focalizando através dos planos ópticos do meio no poço. No entanto, apenas uma fração das células sanguíneas terá aderido à superfície da lâmina até esse momento, um fato que precisa ser considerado ao modificar este protocolo para abordagens baseadas em fixação celular.
4. Quantificação:
   1. Tire imagens dos hemócitos assentados sob um microscópio fluorescente (Figura 2B, D, F). Em seguida, a quantificação dos hemócitos usando o software ImageJ.
   2. Prepare a imagem para o algoritmo de contagem de células ImageJ:
      1. Abra a imagem do poço usando ImageJ: Arquivo → Abra → (localize o arquivo e selecione).
      2. Certifique-se de que a(s) imagem(ns) seja(m) de 8 bits ou 16 bits. Ajuste o limite da imagem selecionando Imagem, clique em Ajustar e selecione Limiar. Observe a "janela de limiar" (Figura 3A).
      3. Marque a opção "Fundo escuro". Selecione "Vermelho" e aumente o Nível de Limite Inferior (veja a seta preta) até que cada célula da imagem seja marcada com um ponto vermelho (as células que não estão sendo cobertas serão vistas em tons de cinza; Figura 3B). À medida que o Limite Inferior é aumentado, algumas células ficam desmarcadas. Este pode ser o indicador de até que ponto definir o Limite Inferior.
         nota: Ocasionalmente, aglomerados de células não podem ser resolvidos e seriam contados como um pelo contador de partículas. Nesses casos, o número de células em um cluster pode ser estimado examinando a imagem (ampliando se necessário) e contando manualmente usando um contador de contagem. Alternativamente, o Limite Inferior pode ser aumentado para resolver aglomerados de células; Quaisquer células não marcadas resultantes dessa manipulação podem ser contadas usando um contador de contagem.
   3. Analise o número de células usando ImageJ:
      1. Inicie o Analisador de Partículas para contar as células (Figura 3C). Selecione Analisar e clique em Analisar partícula. Opcionalmente, selecione "Sobrepor contornos" para ver as partículas que o algoritmo conta (Figura 3D). Como alternativa, defina um limite para o tamanho ou área de pixels de uma unidade (por exemplo, célula, aglomerado de células, etc.) para que o algoritmo conte.
      2. Clique em OK. Observe uma janela de resumo com a contagem (Figura 3E).

2. Ensaio de Distúrbio de Henócito

1. Para perturbar os hemócitos, selecione as larvas e coloque-as em um tubo de microcentrífuga de 2 ml com aproximadamente 0,5 g de esferas de vidro (212 - 600 μm) e adicione 0,5 ml de água.
2. Vortex o tubo, manualmente, na velocidade 10 por 1 min.
3. Recupere as larvas das contas de vidro derramando o conteúdo do tubo de microcentrífuga em uma placa de Petri e escolhendo as larvas com um pincel.
4. Para a fase de recuperação, coloque as larvas em placas de Petri previamente preparadas com pequenas quantidades de comida para moscas. Permita que as larvas restabeleçam seu padrão de hemócitos por um período de 45 min ou conforme desejado.
   nota: Descarte todas as larvas que pararam de se mover, pois morreram no processo. No entanto, normalmente vemos poucos danos após 1 minuto de vórtice.
5. Após o período de recuperação, continue com o ensaio de sangria/raspagem conforme descrito acima na Seção 1.

Resultados

Figura 1. Configuração e esquema do ensaio de sangramento/raspagem e perturbação de hemócitos. (UMA)Configuração de slide de imagem única: cinco quadrados de 2 mm para imagens com uma objetiva de 5X. (B) Configuração de slides de varredura de ladrilhos: quatro quadrados de 3 mm para sangramento/arranhões de larvas de ≤2,5 mm com um microscópio de varredura de ladrilhos. Os objetivos ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de Petri de 6 cm / 9 cm			Um para cada genótipo a ser avaliado
Garrafa de esguicho de água
Colher/espátula de metal
Pincel fino			por exemplo, um "liner"
Prato de cavidade de vidro
Pena PAP: PENA super IM3580 do PAP	Beckman Coulter
Lâminas de vidro			Cada slide terá 5 ou mais quadrados PAP PEN desenhados neles. O tamanho dos quadrados depende da objetiva de imagem e da ampliação da câmera do microscópio; por exemplo, quadrados de 2 mm.
Câmara úmida			Isso será usado para evitar que deslizamentos e poços sequem: recipiente selado com toalhas de papel molhadas forrando as laterais / fundo
Meios de cultura de células de Drosophila de Schneider	Invitrogen
Bloco frio			Este é um bloco de metal (também conhecido como bloco de aquecimento) resfriado em balde contendo gelo; de preferência de cor preta ou outra cor escura e não reflexiva
Duas seringas de 1ml com agulhas (27G 1/2)	Becton Dickinson		Para dissecações.
Opcional: Tesoura de mola cirúrgica (ponta de 2 mm)	Ferramentas de Belas Ciências
Contas de vidro, 212-600 mícrons	sigma
Tubos Eppendorf de 2 ml	Eppendorf		Um por genótipo avaliando
Misturador de vórtice	Fisher Científico
Larvas de Drosophila transgênicas com hemócitos marcados com fluorescência. Os transgenes adequados incluem: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP e -GFP (Gajewski et al., 2007) ou HmlΔ-GAL4 (Sinenko e Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (por H. Agaisse (Stramer et al., 2005)) ou eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combinado com UAS-GFP ou outros transgenes de proteína fluorescente.
Microscópio de dissecação por fluorescência	Leica		Aqui: Leica M205, opcional com câmera, software de imagem e módulo de medição
Microscópio de fluorescência invertida com acessório de câmera	Leica ou Keyence		Com ou sem função de digitalização de ladrilhos (por exemplo. Série Leica DMI, série Keyence BIOREVO BZ-9000)