Uma técnica de coloração de tetrâmero Peptide-MHC-I para analisar células T de memória CD8+ específicas para SIV

Resumo

Fonte: Gonzalez-Nieto, L., et al. Análise de células T CD8⁺ específicas do vírus da imunodeficiência símia em macacos Rhesus por coloração de tetrâmero Peptide-MHC-I. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra um método para caracterizar células T de memória CD8⁺ específicas para o vírus da imunodeficiência símia (SIV) usando tetrâmeros de classe I do complexo de histocompatibilidade principal peptídico (pMHC-I). Um tetrâmero pMHC-I é um complexo de quatro moléculas de MHC-I ligadas a peptídeos específicos do SIV e conjugadas a um fluoróforo. Esses tetrâmeros se ligam seletivamente aos receptores de células T (TCRs) em células T CD8⁺ específicas para SIV, facilitando a caracterização dessas células.

Protocolo

1. Tratamento de PKI

NOTA: Isso é opcional, mas recomendado para tetrâmeros Mamu-B*017:01.

1. Ressuspender PBMC em meio R10 a uma concentração de 1,6 x 10⁷ células/ml.
2. Adicionar 50 μl desta suspensão celular aos tubos de citometria de fluxo correspondentes. Adicionar 50 μl de uma solução de PKI a 100 nM a cada tubo.
3. Vórtice cada tubo. Incubar a 37 °C durante 30 min. Ao final desta etapa, cada tubo deve ter 100 μl de uma suspensão celular contendo 8,0 x 10⁵ PBMC e 50 nM de PKI.
4. Prossiga para a etapa de coloração do tetrâmero pMHC-I.

2. Coloração com tetrâmeros pMHC-I marcados com fluorocromo

1. Antes de preparar a mistura principal de tetrâmero pMHC-I, centrifugue os tubos de tetrâmero pMHC-I a 20.000 x g por pelo menos 15 min a 4 °C. O objetivo desta etapa é granular agregados de proteínas na solução de tetrâmero pMHC-I que podem aumentar a coloração de fundo. Uma vez concluída a etapa de centrifugação, evite pipetar do fundo do tubo onde os agregados de proteínas se acumularão.
2. Prepare uma mistura mestra de tetrâmero pMHC-I suficiente para corar todos os tubos experimentais. Prepare um excesso de 15% do volume total desta mistura master para contabilizar erros de pipetagem.
3. Dilua os tetrâmeros pMHC-I em tampão de coloração (por exemplo, Brilliant Stain Buffer) para que 25 μl da mistura mestre de tetrâmeros pMHC-I sejam adicionados a cada teste.
   1. Rotular PBMC com dois tetrâmeros pMHC-I por teste; um conjugado à aloficocianina (APC) e o outro à Violeta Brilhante (BV) 421.
4. Adicionar 8,0 x 10⁵ PBMC aos tubos de citometria de fluxo correspondentes, num volume final de 100 μl. Se as células foram submetidas ao tratamento PKI descrito acima, elas já devem ser ressuspensas em 100 μl nesta etapa.
5. Adicionar 25 μl de mistura principal de tetrâmero pMHC-I aos tubos de citometria de fluxo correspondentes. Ao final desta etapa, o volume final em cada tubo deve ser de 125 μl.
6. Vortex cada tubo para homogeneizar a suspensão celular.
7. Incube no escuro em temperatura ambiente por 45 min. Prepare o coquetel de anticorpos monoclonais (mAb) de coloração superficial durante esta incubação de 45 minutos.

3. Coloração de superfície

1. Prepare a mistura mestre de mAb suficiente para corar todos os tubos experimentais. Prepare um excesso de 15% do volume total desta mistura master para contabilizar erros de pipetagem.
2. Ajuste o volume da mistura principal com tampão de mancha para que 50 μl sejam adicionados por teste.
3. Para a exclusão adequada de células T não CD8⁺ e delineamento de subconjuntos de memória, use quantidades tituladas de mAbs direcionadas contra as seguintes moléculas na mistura mestre de coloração de superfície.
   nota: Os fluorocromos conjugados a cada mAbs são fornecidos como referência: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7 e CCR7 FITC. Observe que os mAbs contra CD14, CD16 e CD20 são conjugados ao mesmo fluorocromo (ou seja, BV 510), pois serão incluídos na porta de "despejo".
4. Inclua um corante fixável para discriminar as células mortas na mistura principal de coloração da superfície [ou seja, corante reativo à amina (ARD)]. Certifique-se de que o reagente ARD esteja conjugado a um fluorocromo com um espectro de emissão semelhante aos usados na porta de "despejo". Nesse caso, use o ARD Aqua.
5. Adicionar 50 μl da mistura principal de coloração descrita nos pontos 3.1-3.4 aos tubos de citometria de fluxo correspondentes. Ao final desta etapa, o volume final em cada tubo deve ser de 175 μl.
6. Vórtice cada tubo. Incube no escuro em temperatura ambiente por 25 min.
7. Lave as células com tampão de lavagem (solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,1% de albumina de soro bovino e 0,45 g/L de NaN3).
   cuidado: A azida de sódio (NaN₃) é uma substância tóxica. A exposição a quantidades mínimas pode causar sintomas. Manuseie esta substância de acordo com as diretrizes especificadas pelo Escritório de Saúde e Segurança Ambiental (EHS) da instituição onde esses experimentos estão sendo realizados.
8. Centrifugar os tubos a 510 x g durante 5 min. Decantar cuidadosamente o sobrenadante para um recipiente de resíduos separado. Certifique-se de não mexer no pellet.
   cuidado: Não decantar o sobrenadante do tampão de lavagem em reservatórios que contenham lixívia, pois pode reagir com a azida de sódio presente no tampão de lavagem e resultar na formação de um gás tóxico. Entre em contato com o Escritório de EHS da instituição onde esses experimentos estão sendo realizados para obter orientações sobre como descartar a azida de sódio.
9. Após a decantação, vórtice as células no líquido restante retido em cada tubo.

4. Fixação celular

1. Adicione 250 μl de uma solução de paraformaldeído (PFA) a 2% a todos os tubos para fixar as células.
   CUIDADO: O PFA é uma substância tóxica. A exposição a quantidades mínimas pode causar sintomas. Manuseie esta substância de acordo com as diretrizes especificadas pelo Escritório de EHS da instituição onde esses experimentos estão sendo realizados.
   1. Como a solução de PFA a 2% deve ser isotônica para as células, use PBS para preparar esta solução. Cem mililitros de uma solução de PFA a 2% são suficientes para vários experimentos. Vortex completamente todos os tubos imediatamente após a adição de 2% de PFA para evitar a formação de agregados celulares.
2. Incubar no escuro a 4 °C durante 20 min.
3. Lave as células repetindo as etapas 3.7-3.9. Uma vez concluída esta etapa, as células podem ser armazenadas no escuro a 4 °C por 24-48 horas. Antes de prosseguir para a fase de permeabilização, vórtice os tubos completamente.

5. Permeabilização de células

1. Adicione 500 μl de tampão de permeabilização. Vórtice todos os tubos.
2. Incube no escuro em temperatura ambiente por 10 min.
3. Lave as células repetindo as etapas 3.7-3.9.

6. Coloração intracelular

1. Prepare a mistura mestre de mAb suficiente para corar todos os tubos experimentais.
2. Ajuste o volume com PBS ou tampão de coloração para que 50 μl da mistura principal de mAb intracelular sejam adicionados por teste.
3. Preparar a master mix de mAb descrita em 6.1 e 6.2 utilizando quantidades tituladas de mAbs dirigidas contra CD3 e granzima B (Gzm B).
   nota: O envolvimento do TCR por tetrâmeros pMHC-I pode resultar na internalização de CD3, o que pode interferir na detecção de tetrâmero + células T CD3⁺ CD8⁺ se o mAb anti-CD3 for adicionado à mistura principal de coloração de superfície. Para evitar isso, adicione o mAb anti-CD3 nesta fase, ou seja, após as células serem permeabilizadas. Os fluorocromos conjugados a cada mAb são listados como referência: CD3 PerCP Cy5.5 e Gzm B PE.
4. Adicione 50 μl de coquetel de mAb aos tubos correspondentes. Incube no escuro em temperatura ambiente por 30 min.
5. Lave as células repetindo as etapas 3.7-3.9. Os tubos estão prontos para serem adquiridos em um citômetro de fluxo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dasatinibe	Axônio medchem	Axônio 1392	Deve ser ressuspenso em DMSO e imediatamente armazenado a -20°C
RPMI c/ Glutamax	gibco/ Tecnologias de Vida	Nº 61870-036	Deve ser conservado a 4 °C
FBS inativado por calor	gibco/ Tecnologias de Vida	10082-147	Deve ser conservado a 4 °C
Penicilina-estreptomicina-anfotericina B	Lonza	17-745E	Deve ser conservado a 4 °C
DMSO anidro	Tecnologias da Vida	D12345	Armazene em temperatura ambiente.
Tubos de polipropileno de fundo redondo de 5 mL	VWR	Nº 60819-728
Tetrâmeros pMHC-I conjugados com fluorocromo	NIH Tetramer Core ou MBL, Inc.		Deve ser armazenado e mantido a 4 °C. Centrifugue a 20.000 x g por 15 min antes de usar. Não congele.
MAbs conjugados com fluorocromo	Várias empresas		Deve ser conservado e mantido a 4 °C. Não congele.
Kit de Mancha de Célula Morta Aqua Fixável LIVE/DEAD	Tecnologias da Vida	l34957	Deve ser conservada a -20 °C. Ressuspender cada alíquota em 50 μL de DMSO antes da utilização.
Tampão de manchas brilhante	BD Biociências	563794	Deve ser conservado a 4 °C
Solução salina tamponada com fosfato	VWR	Rolamento 97064-158	Armazene em temperatura ambiente
Albumina Bovina	VWR	Rolamento 700011-230	Deve ser conservado a 4 °C
Azida de sódio	VWR	Rolamento 97064-646	Armazene em temperatura ambiente. Substância tóxica. Não misture com água sanitária.
branquear	VWR	Rolamento 89501-620	Produto químico corrosivo, não pode ser misturado com azida de sódio. Manuseie com cuidado
Paraformaldeído	Ciências da Microscopia Eletrônica	15714-S	Reagente inflamável, corrosivo e tóxico. Manuseie com cuidado
Polissorbato 20 (Tween-20)	Alfa Aesar	L15029	Armazene em temperatura ambiente
Solução de permeabilização 2	BD Biociências	340973	Reagente tóxico e corrosivo. Manuseie com cuidado
Tubos Sarsdet 1,5mL tampa de rosca	VWR	Nº 72.692.005
Tubos de baixa ligação de DNA / RNA de 2,0 ml	Eppendorf	22431048	O uso de microtubos estéreis é preferido
Misturador de vórtice
Gabinete de Biossegurança
Sistema de purificação de água Milli Q Intergral	EMD Millipore	ZRXQ010WW	Água de grau de Biologia Molecular de qualquer fornecedor pode ser usada
Microcentrífuga
centrifuga
Geladeira 4 °C
BD LSR II	BD Biociências		O citómetro de fluxo deve conter lasers e filtros compatíveis com o painel de coloração utilizado.
Água deionizada
Folha de alumínio	VWR SCIENTIFIC INC.	Rolamento 89068-738
incubadora			Deve ser capaz de manter uma temperatura interna de 37 °C
Software FACS Diva	BD Biociências
Software Flowjo versão 9.6	Flowjo		Usado para analisar arquivos FCS gerados pelo software FACS Diva
Pontas de micropipeta