1. Marcação fluorescente e perfusão de leucócitos (PMN ou THP-1 para humanos e RAW264.7 ou monócitos primários de camundongo para ensaio baseado em fluxo murino)
- Rotulagem fluorescente
- Rotule os leucócitos (1 x 106 / mL) com a coloração de ácido nucleico fluorescente verde permeável (1 μM). Incubar as células durante 30 min a 37 °C.
- Lave as células com PBS por centrifugação a 300 x g por 5 min e suspenda as células a uma concentração de 0,5 x 106 células/mL (5 mL por condição de teste, dependendo da taxa de fluxo) em tampão de ensaio.
- Preparação do ensaio da câmara de fluxo
- Para a adesão de leucócitos em uma monocamada de células, descarte o meio de cultura de células do prato e monte-o na câmara de fluxo. Conecte o tubo à seringa. Para a adesão de leucócitos em plaquetas imobilizadas, conecte a microlâmina à seringa. Pré-aqueça um banho-maria a 37 °C.
- Pegue uma seringa de perfusão (50 mL), instale a seringa no suporte da seringa e coloque a bomba no modo de retirada. Defina o volume da bomba para 0 mL e defina o diâmetro para 26,70 mm para a seringa de 50 mL.
- Conecte um conector luer de cotovelo a uma extremidade da tubulação. Coloque um acoplador luer lock na seringa e conecte a tubulação com o conector luer de cotovelo ao acoplador luer lock. Conecte a extremidade livre da tubulação à câmara de fluxo.
- Perfusão e adesão leucocitária
- Para a adesão de leucócitos em uma monocamada de células, descarte o meio de cultura de células do prato e monte-o na câmara de fluxo. Conecte o tubo à seringa. Para a adesão de leucócitos em plaquetas imobilizadas, conecte a microlâmina à seringa.
- Para perfusão e adesão de leucócitos sobre uma monocamada vascular ou plaquetária, coloque o segundo tubo em um tubo cônico de 50 mL contendo tampão de ensaio e encha o tubo com pipeta de 1 mL, em seguida, aperte o tubo e conecte-o a uma câmara de fluxo.
- Antes da perfusão leucocitária, adicione 3 mM de CaCl2 e 2 mM de MgCl2 à suspensão celular e incube por 5 min a 37 °C.
- Perfundir o tampão do ensaio antes da perfusão das células para remover o ar possível da câmara e da tubulação.
- Feche as extremidades dos tubos apertando-as com força e trocando a tubulação do tampão de ensaio para a suspensão da célula, evitando que as bolhas de ar fiquem presas. Perfundir células com taxa de fluxo/tensão de cisalhamento apropriadas até que as primeiras células cheguem.
- Perfunda células com taxa de fluxo/tensão de cisalhamento apropriada por 2 min e capture pelo menos 6 imagens entre 2 e 6 min de células rolantes e aderentes com um microscópio de contraste/fluorescência de fase invertida (por exemplo, EVOS-FL) usando ampliação de 100X conectada a uma câmera digital CCD ou CMOS.
NOTA: A taxa de fluxo/tensão de cisalhamento depende das dimensões da câmara de fluxo e da viscosidade do perfusato. Para a câmara de perfusão usada aqui (ver Tabela de Materiais):
τ=η*97.1*Φ
τ: tensão de cisalhamento (1 din/cm2)
η: viscosidade (0,015 din*s/cm2)
Φ: Taxa de fluxo (0,67 mL / min)
- Desadesão leucocitária
- Para desaderência, troque a tubulação da suspensão da célula para o tampão de ensaio apertando a tubulação, evitando que as bolhas de ar fiquem presas.
- Separar as células por perfusão com tampão de ensaio com uma taxa de fluxo/tensão de cisalhamento apropriada (ver nota 3.3.7).
- Transmigração de leucócitos
- Para transmigração de leucócitos, perfundir leucócitos (etapa 3) até que uma quantidade adequada de leucócitos adira (~ 50 células / campo de visão).
- Substitua a suspensão leucocitária por tampão de ensaio.
- Registre as células transmigratórias por lapso de tempo a cada 10-15 s por 30-60 min a 37 ° C.
