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1. Fabricação de nanoestruturas
- Escolha lamínulas de vidro de 25 mm de diâmetro com uma espessura aproximada de 170 μm (nº 1,5) como substratos para nanofabricação.
- Mergulhe as lamínulas em solução de piranha (proporção de 3:1 de ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio) por pelo menos 6 horas. Lave a lamínula embebida em piranha com grandes quantidades de água destilada desionizada ultrapura de 18,2 MΩ (DDW).
cuidado: O ácido de piranha reage violentamente com materiais orgânicos e deve ser manuseado com extremo cuidado.
- Deposite filme fino de cromo de 10 nm nas lamínulas por evaporação do feixe eletrônico para evitar efeitos de carga durante a padronização e a imagem de nanoestruturas.
- Gire a primeira camada de resistência de bicamada consistindo de copolímero de metacrilato de metila (MMA_EL6) de lactato de etila a 2.000 rpm por 45 segundos e depois asse a 150 ° C. Gire a segunda camada de polimetilmetacrilato (950PMMA_A2) a 3.000 rpm por 45 segundos e depois asse a 180 ° C.
- Padrão a resistência da bicamada usando a litografia por feixe de elétrons (EBL) a 25 kV com uma dose de área de 300 μC / cm2. Desenvolver em álcool isopropílico (IPA)/metil isobutilcetona (MIBK): 2/1 e enxaguar em IPA.
- Deposite filme de Ti (5 nm) / Au (80 nm) no substrato usando um evaporador de feixe eletrônico.
- Após a deposição de ouro, levante a resistência de bicamada de copolímero embebendo o substrato em acetona por 4 horas.
- Inspecione o substrato usando o microscópio eletrônico de varredura (SEM) para confirmar a forma e o tamanho da nanoestrutura, remova o cromo restante do substrato por meio de condicionamento úmido usando CR-7
- Projete um espaçamento de matriz de centro a centro de 33 μm para deixar espaço para imagens de células entre as matrizes. Padronize as nanoestruturas em um padrão de 20 x 20 para cada matriz com um passo de 300 nm usando um gravador de feixe eletrônico. Cada chip contém 300 matrizes com uma dimensão nanoestrutural típica de 80±2,5 nm de altura e 70±2,5 nm de diâmetro.
- Inspecione um subconjunto de matrizes usando o microscópio de força atômica (AFM) para a verificação de tamanho e uniformidade.
- Prenda um anel de suporte, normalmente de silicone, na parte de trás da lamínula usando um epóxi de cura UV.
2. Limpeza de cavacos e aplicação de monocamada automontada
- Para limpar e regenerar os cavacos, cinzas de plasma a uma potência de 40 W em uma mistura de 300 mTorr de 5% de hidrogênio e 95% de argônio por 45 segundos após a limpeza da câmara por 5 min nas mesmas condições.
- Funcionalize as nanoestruturas de ouro imediatamente após a incineração do plasma, imergindo o chip em uma solução de tiol etanólico de dois componentes consistindo em uma proporção de 3:1 de SH-(CH2)8-EG 3-OH (SPO) e um componente com um grupo funcional amina ou carboxila, ou seja, SH-(CH2)11-EG 3-NH 2 (SPN) ou SH-(CH2)11-EG 3-COOH (SPC).
- Deixe o chip na solução de tiol O/N para formar uma monocamada auto-montada (SAM).
- Enxágue o chip com etanol e seque-o com gás nitrogênio.
- Se necessário, armazene o chip funcionalizado por até 2 semanas a 4 °C.
- Quando estiver pronto para uso, reaja o componente SPN ou SPC com o ligante usando uma química dependendo do ligante de escolha (veja abaixo).
nota: Os chips podem ser regenerados e refuncionalizados dezenas de vezes. Um determinado chip pode ser usado por períodos que variam de 6 meses a mais de um ano. Os espectros medidos em uma determinada matriz são reproduzidos de forma confiável após repetidas regenerações por cinzas de plasma, seguidas de biofuncionalização.
3. Funcionalização de Superfície e Caracterização Cinética
Nota: Use o chip funcionalizado no instrumento SPR comercial para caracterizar as constantes de taxa cinética entre o ligante e o analito, bem como para estudar a resistência do SAM à ligação não específica. Há uma ampla gama de taxas de fluxo e designs microfluídicos que permitem uma funcionalização eficiente da superfície. Como temos um SPR disponível comercialmente, padronizamos suas taxas de fluxo recomendadas. Observamos que essas taxas de fluxo são típicas de todos os instrumentos SPR e, portanto, não são restritivas. O instrumento SPR não é uma necessidade, pois toda a funcionalização pode ser feita diretamente no chip de ressonância plasmônica de superfície localizada (LSPR), mas reduziu nossa carga de trabalho porque é um instrumento multiplexado, enquanto nossa configuração microfluídica LSPR não é.
- Funcionalize uma ficha de ouro nua comercial com o SAM, conforme descrito na Seção 2.
- Se estiver usando um SAM baseado em SPC, ative o grupo carboxila com uma mistura 1:1 de 133 mM de 1-etil-3-(3-dimetil aminopropil) carbodiimida (EDC) e 33 mM de N-hidroxisuccinimida (NHS) em DDW por 10 min.
- Conjugue o grupo carboxila ativado com o anticorpo/ligante de interesse por 300 segundos usando uma taxa de fluxo de 30 μl/min. Prepare os ligantes em tampão fosfato de pH 6, normalmente, mas isso pode variar dependendo da molécula.
- Após a conjugação do ligante, flua 0,1 M de etanolamina em solução salina tamponada com fosfato (PBS) como uma etapa de desativador por 300 segundos a uma taxa de 30 μl/min. A etanolamina ajuda a minimizar a ligação não específica.
- Introduzir a substância a analisar de interesse a um caudal de 100 μl/min utilizando uma gama de concentrações e calcular as constantes de taxa cinética utilizando um software de análise cinética.
- Se a associação não específica for problemática, aumente a proporção de SPO para SPC ou SPN.
4. Configurações gerais do LSPR
- Configurações do microscópio:
- Use uma lâmpada halógena de 100 W para Koehler iluminar a amostra. Use um filtro passa-longo (normalmente corte de 593 nm) no caminho da luz para eliminar comprimentos de onda que não contribuem para o deslocamento de ressonância (Figura 1).
- Para a coleta de dados LSPRi, use um microscópio invertido com uma objetiva de imersão em óleo de 40X (1,4 NA) e uma câmera CCD de 16 bits resfriada termoeletricamente.
- Coloque um divisor de feixe na porta de saída do microscópio para obter imagens e espectros simultaneamente.
- Ajuste o microscópio com temperatura controlada stage para 37 °C e equilibre por 4 horas.
- Incorpore um conjunto de incubação adicional no microscópio para regular a concentração e a umidade de CO2 em 5% e 95%, respectivamente.
- Preparação e montagem de cavacos:
- Funcionalize o chip LSPR conforme descrito na Seção 2 com as proporções ideais de SAM de dois a 8 componentes determinadas a partir dos experimentos SPR.
- Carregue o chip dentro de um suporte microfluídico feito sob medida da seguinte maneira. Coloque o chip em uma peça inferior de alumínio. Coloque o chip entre esta peça inferior e uma junta de silicone e uma peça superior de plástico transparente. Use 4 parafusos para clamp o conjunto.
- Para uma aplicação típica de tióis à base de SPC, revestir 300 μl de uma mistura 1:1 de 133 mM de EDC e 33 mM de NHS em DDW para ativar os grupos carboxila do componente tiol SPC.
- Aguarde 10 min e enxágue manualmente a superfície com PBS 10 mM.
- Conjugar o grupo carboxilo ativado com o ligante (normalmente um anticorpo ou fragmento de anticorpo) de interesse por meio de um revestimento de 300 μl de solução ligante.
- Aguarde 30 min e enxágue manualmente com PBS 10 mM.
- Camada de 300 μl de etanolamina 0,1 M em PBS no chip para minimizar a ligação inespecífica. Aguarde 10 min.
- Lave a etanolamina com PBS contendo 0,005% de Tween 20 (PBS-T20).
- Coloque uma peça de quartzo acima do chip para reduzir as flutuações nos dados relacionados a um menisco em mudança.
- Mantenha o chip úmido com tampão PBS-T20 enquanto o monta no microscópio.
- Coloque o conjunto do chip LSPR firmemente no suporte de amostra do estágio aquecido e conecte a tubulação microfluídica.
- Conecte a tubulação microfluídica ao conjunto e ao tampão de fluxo (ou meio sem soro para estudos celulares) até que um estado estacionário seja alcançado.
- Deixe o conjunto e o microscópio se equilibrarem por pelo menos 2 horas.
- Alinhe o chip usando um joystick para que a matriz central fique alinhada com a fibra óptica para espectroscopia. Os dados espectroscópicos são obtidos usando um espectrômetro e um software de análise espectral.
- Mantenha as matrizes em foco durante todo o experimento usando o foco automático do software, o Zeiss Definite Focus ou um dispositivo de foco automático equivalente.
5. Imagens LSPR de secreções anti-c-myc de células de hibridoma 9E10
Nota: A linhagem celular de hibridoma usada para este estudo expressa o anticorpo anti-c-myc constitutivamente e, portanto, não requer um gatilho químico
- Funcionalize as nanoestruturas com o peptídeo c-myc. Isso tem um valor KD de 1,77 nM para os anticorpos anti-c-myc secretados pelas células do hibridoma clone 9E10.
- Cultivar as células do hibridoma em meio de crescimento completo com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico em um frasco T75 a 37 °C sob 5% de CO2. Mantenha uma densidade celular de 4 ×105 células/ml.
- Para os estudos de secreção celular, células pellets do frasco T75 por centrifugação, lavar duas vezes com meio livre de soro RPMI-1640 (SFM) para remover os anticorpos secretados e ajustar a densidade celular para 4 ×106 células/ml.
- Colha as células e teste a viabilidade antes de introduzi-las nos chips LSPR.
- Introduzir manualmente 50 μl da solução celular nas pastilhas LSPR com uma micropipeta. Após alguns minutos, 25 a 50 células aderem à superfície dos chips LSPR.
- Lave as células restantes em solução com SFM fresco usando o sistema de perfusão microfluídica.
- Selecione as matrizes LSPR para imagens próximas, dentro de 10 μm, mas não sobrepostas às células.
- Para garantir que o sinal seja específico para os anticorpos anti-c-myc secretados, introduza os meios de cultura celular com e sem os anticorpos presentes, bem como com os anticorpos, mas com seus locais de ligação bloqueados pela presença de uma concentração saturada de peptídeo c-myc na solução.
- Calibre os sensores no final de cada corrida com uma solução saturante de anticorpos anti-c-myc (250 nM). Isso ajuda a normalizar a resposta dos sensores e determinar a ocupação fracionada com base no perfil de biofuncionalização de cada corrida.
- Corrija o desvio nas direções X e Y usando um software de alinhamento de imagem.
