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1. Titulação de vírus
NOTA: Dependendo do número de vírus e do número de duplicatas, uma placa de poço pode ser configurada com as seguintes flexibilidades: (1) A diluição viral pode ser organizada ao longo das linhas ou das colunas (Figura 1). Cada vírus deve ocupar uma linha/coluna separada. (2) O incremento de diluição viral é flexível, mas deve começar com a concentração viral mais alta no canto superior esquerdo. (3) Não há restrição quanto ao número de duplicatas.
- Alíquota de células MDCK ou células MDCK-SIAT8 suficientes em placas de 96 poços (200 μl/poço). Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 2 ou 3 dias para atingir a confluência. Propague as células em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bezerro inativado pelo calor (FCS) e antibióticos (100 U / ml de penicilina e 100 μg / ml de estreptomicina). Incubar as células SIAT a 37 °C com 5% de CO2 e 1 mg/ml de sulfato de G418.
nota: O factor de diluição depende da experiência e da linhagem celular utilizada. A monocamada celular deve ser confluente (ou seja, sem parede celular ou contorno visível para células MDCK e um layout bem compactado para células MDCK-SIAT1) no momento da inoculação do vírus. O quadro 1 apresenta exemplos de diluições baseadas na subcultura de frascos confluentes de células MDCK ou MDCK-SIAT1.
- Lave as células 3 vezes com 200 μl de meio de crescimento viral (VGM) por poço. Esterilize a lavadora de placas multifoliadas com EtOH 70% por 30 min e, em seguida, enxágue-a em solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) ou VGM antes da lavagem.
- Aspire o VGM e adicione imediatamente 50 μl de VGM a cada poço.
- Adicione 900 μl de VGM a cada um dos 6 tubos estéreis (ou menos, dependendo do número de vírus de teste e duplicatas). Pipetar 100 μl de vírus para o primeiro tubo, misturar bem e diluir em série, mudando as pontas entre cada diluição. Repita para cada vírus a ser titulado.
nota: Isso dará diluições de vírus de 10-1 a 10-6.
- Adicione 50 μl de cada diluição do vírus, começando na diluição mais alta (1 x 10-5 na Figura 1), aos poços duplicados (Colunas 9 e 10 na Figura 1) de uma placa de 96 poços.
- Coloque a placa a 37 °C por 2-3 horas para permitir que o vírus infecte as células.
nota: Uma incubação de 2 a 3 horas é necessária para garantir que os vírus no inóculo tenham tempo suficiente para atingir a monocamada.
- Prepare a cobertura (10 ml/placa)
nota: A cobertura consiste em 5 ml de 2x DMEM, tripsina (concentração final de 2 μg/ml), 20 μl de estoque de 1 mg/ml e 5 ml de linters de algodão de celulose (consulte a Lista de Materiais).
- Remova o inóculo.
- Adicione a cobertura (200 μl a cada poço). Incubar durante a noite a 37 °C, NÃO PERTURBADO.
nota: O brotamento do vírus ocorre após aproximadamente 4 horas, por isso é importante que a placa não seja perturbada após esse período.
- Aspire a cobertura dos poços.
- Adicione paraformaldeído a 4% gelado em PBS A (200 μl / poço). Coloque-os a 4 °C por 30 min ou em temperatura ambiente por 20 min.
NOTA: PBS A é solução salina tamponada com fosfato de pH natural com 10 g de NaCl, 0,25 g de KCl, 1,437 g de Na2HPO4, 0,25 g de KH2PO4 e 1 L de água destilada (consulte a Lista de Materiais).
NOTA: O paraformaldeído é prejudicial quando inalado e pode causar queimaduras se ingerido. Também há evidências limitadas de um efeito carcinogênico e pode causar sensibilização após o contato com a pele.
- Aspirar o paraformaldeído e lavar as placas duas vezes com PBS A (200 μl/alvéolo).
- Armazene as placas em PBS A a 4 °C para uso futuro ou continue com as etapas a seguir.
- Adicione tampão de permeabilização (100 μl/poço). Deixe em temperatura ambiente por 30 min.
- Lavar a placa duas vezes com PBS A (200 μl/poço).
- Adicione 50 μl do primeiro anticorpo, MAb de camundongo contra influenza tipo A (1:1.000 em tampão ELISA), por poço. Incube-o em temperatura ambiente por 1 hora (ou 4 ° C durante a noite), agitando.
- Lave-o 3 vezes em 100 μl de tampão de lavagem (0,05% Tween 80 em PBS A, v/v) por poço. Incube em temperatura ambiente por 5 min entre as lavagens. Como alternativa, lave-o 3 vezes sem incubação usando 300 μl por poço.
- Adicione 50 μl do segundo anticorpo, conjugado HRP IgG (H + L) anti-camundongo de cabra (1: 1.000 em tampão ELISA), por poço. Incube em temperatura ambiente por 1 hora, agitando.
- Lave-o 3 vezes conforme descrito na etapa 1.17.
- Adicionar o substrato (50 μl/alvéolo). Incube-o em temperatura ambiente por 30 min ou até que o desenvolvimento de uma cor azul seja claramente visível.
- Para interromper a reação, lave a placa duas vezes com 200 μl de água destilada por poço, incubando em temperatura ambiente por 2 a 3 min entre as lavagens.
- Seque o prato ao ar livre e guarde-o em um local escuro (por exemplo, embrulhe-o em papel alumínio).
2. Neutralização de vírus
NOTA: Calcule o número de placas necessárias para o ensaio de neutralização. Cada placa pode acomodar um vírus e vários anti-soros.
NOTA: Dependendo do número de anti-soros e do número de duplicatas, uma placa de poço pode ser configurada com as seguintes flexibilidades: (1) A diluição do soro pode ser disposta ao longo de uma linha ou coluna (Figura 2). Cada soro deve ocupar uma linha ou coluna separada. (2) O incremento da diluição do soro é flexível, mas deve começar com a concentração sérica mais alta no canto superior esquerdo de uma placa. (3) O número de duplicatas equilibra o número de anti-soros. Mais duplicatas podem ajudar a suavizar as variações experimentais. (4) O número de VC e o número de duplicatas de controle de célula (CC) são flexíveis, mas também devem estar em linhas ou colunas separadas. Espera-se que o número de duplicatas de CV seja significativamente maior do que o dos anti-soros.
- Prepare a monocamada celular, como nas etapas 1.1-1.3, com 2 ou 3 dias de antecedência.
- Adicione 50 μl de VGM a cada poço da placa.
- Use as colunas 11 e 12 para VC e CC, respectivamente. Adicionar alíquotas de 50 μl de soro tratado com enzima destruidora de receptores (RDE) 1:20 à primeira linha (A) das colunas 1-10.
nota: Para cada combinação de vírus e soro, o ensaio é realizado em duplicata, portanto, uma placa pode, por exemplo, conter um vírus testado contra cinco anti-soros.
- Efectuar diluições seriais de 2 vezes transferindo 50 μl da linha A para a linha H (colunas 1-10 da figura 2) e rejeitando 50 μl da linha H.
- Adicionar 50 μl de diluente a cada alvéolo da coluna CC (coluna 12 da figura 2).
- Adicionar 50 μl do vírus a cada alvéolo da placa, excepto à coluna CC (colunas 1-11, linhas A-H na figura 2).
- Incube-o a 37 °C durante 2-3 horas. Retire o inóculo. Adicione a cobertura (200 μl) a cada poço. Incubar durante a noite a 37 °C, SEM PERTURBAÇÕES. Fixe e manche as placas como para a titulação do vírus (etapas 1.11-1.22).
3. Quantificação de Neutralização
- Coloque uma placa de poço na área de digitalização de um scanner de mesa, conforme mostrado na Figura 2a. Use o limite de posição em forma de L para garantir um local de imagem ideal e repetível.
nota: É possível obter imagens de duas placas de poços em uma varredura.
- Digitalize a placa.
- Execute o software "Wellplate Reader" para calcular os títulos virais necessários (Figura 3).
- Clique no botão "Carregar imagem" para carregar uma imagem. Deslize a barra vermelha em "Limite Global" para ajustar o limite de amostragem. Clique no botão "Atualizar" para examinar o efeito.
- Marque a caixa "Calcular neutralização/titulação". Clique no botão "Amostragem" para quantificar o PIC. Clique no botão "Salvar" para salvar os resultados da amostragem quando solicitado.
nota: Após o processo de amostragem, uma nova janela chamada "Cálculo de Neutralização e Titulação" aparece automaticamente se a caixa "Calcular Neutralização/Titulação" estiver marcada.
- Carregue ou insira o mapa de placas de poço. Indique o limite (por exemplo, 50%) em "Neutralização: Dedução de Infecção (%)".
- Selecione "Processo de neutralização" para calcular os títulos. Verifique os títulos e clique no botão "Salvar e Fechar" para salvar os resultados da neutralização.
nota: A neutralização é relatada como o recíproco da maior diluição do soro com a redução predefinida da PIC (como 50% ou 80%) em relação à CV (a média da coluna 11 na Figura 4). Uma redução de 50% da PIC foi usada nos Resultados Representativos.
