Quantificando a atividade de sequestro autofágico em massa em células de mamíferos

Resumo

Fonte: Luhr, M. et al., O Ensaio de Sequestro de Lactato Desidrogenase - Um Método Simples e Confiável para Determinar a Atividade de Sequestro Autofágico em Massa em Células de Mamíferos. J. Vis. (2018)

O vídeo demonstra um ensaio para avaliar a atividade de sequestro autofágico em massa em células de mamíferos. Ele utiliza eletroporação para liberar proteínas citosólicas, incluindo lactato desidrogenase (LDH). As frações LDH sequestradas e LDH celular total são determinadas para avaliar o sequestro de LDH, fornecendo informações sobre a atividade geral de sequestro em massa.

Protocolo

1. Semeadura e Tratamento Celular

1. Cultivar células aderentes em frascos de cultura de tecidos de 75 cm² numa incubadora humidificada com 5% de CO₂ a 37 °C, utilizando o meio de cultura preferido para o tipo de célula em questão. Permita que as células cresçam até atingirem uma camada celular quase confluente.
   nota: Use o meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) para LNCaP, HEK293, fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs), BJ, MCF-7 e células RPE-1.
   1. Lave as células com 3 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 37 °C, pH 7,4. Substitua o PBS por 3 mL de tripsina-etilenodiaminotetraacetato (EDTA) a 0,25% (p / v) e incube o frasco em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ a 37 ° C até que as células se desprendam (2–5 min).
   2. Ressuspenda as células destacadas com um meio de cultura de 7 mL contendo 10% de FBS. Misture uma alíquota de suspensão de células de 10 μL com 10 μL de azul de tripano a 0,4% em um tubo de microcentrífuga, usando uma ponta de pipeta de 0,5 a 20 μL. Use a mesma ponta de pipeta para encher imediatamente uma lâmina da câmara de contagem e conte as células em um contador de células automatizado.
2. Prepare uma diluição adequada (veja a nota abaixo) da suspensão celular da etapa 1.1.2 usando um meio de cultura contendo 10% de FBS e semeie 1 mL da suspensão celular diluída em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços (área de superfície ~ 3,8 cm²) usando técnica asséptica. Permitir o crescimento em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ a 37 °C até que a densidade celular desejada seja atingida, por exemplo, 60–90% de confluência na colheita.
   nota: A diluição apropriada da suspensão celular que dará a confluência celular desejada na colheita variará de tipo de célula para tipo de célula, bem como de acordo com a duração e o tipo de tratamentos experimentais. Assim, isso deve ser avaliado empiricamente em cada caso.
   1. Para experimentos que devem ser tratados e colhidos 2 dias após a semeadura, semeie 2,5 x 10⁵ células LNCaP, HEK293 ou MCF-7, 5 x 10⁴ MEFs, 4 x 10⁵ BJ ou 1,5 x 10⁵ células RPE-1 em cada poço da placa de 12 poços.
   2. Para células que aderem frouxamente, cubra as placas com o tipo de revestimento recomendado para o tipo de célula em questão. Para células LNCaP (e HEK293), use placas revestidas com poli-D-lisina (PDL).
   3. Para esse fim, adicione 500 μL de PDL a 2,5 μg / mL em H₂O estéril a cada poço e incube as placas em um ambiente estéril por 30 min à temperatura ambiente (20–25 ° C). Remova o PDL com sucção e lave cada poço brevemente com 1 mL estéril H₂O.
      nota: Geralmente, a etapa 1.2.1 é feita sem nenhum tratamento experimental. No entanto, se estiver realizando RNAi, pode ser conveniente iniciar uma transfecção reversa com a semeadura.
3. Realizar tratamentos experimentais em poços duplicados ou triplicados por condição.
   1. Por exemplo, trate as células com 50 nM do inibidor de mTOR Torin1, que geralmente é um indutor eficiente de sequestro autofágico, ou sujeite as células à falta aguda de soro e aminoácidos lavando as células com 1 mL de meio Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) sem aminoácidos e, posteriormente, incube as células em 1 mL de EBSS em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono (CO₂) a 37 ° C.
   2. Deixe um conjunto de poços sem tratamento para definir os níveis de fundo de lactato desidrogenase sedimentável (LDH).
   3. Adicione uma quantidade saturada do inibidor pós-sequestro bafilomicina A1 (Baf) na ausência ou presença dos tratamentos experimentais, 3-4 h antes da colheita celular. Incubar as células em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ a 37 °C.
      1. Use 100 nM Baf para células LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 e RPE-1 e 10 nM Baf para MEFs.
      2. Para tratamentos experimentais que têm uma duração de apenas 3 a 4 h (como os exemplificados na etapa 1.3.1 normalmente), adicione Baf simultaneamente com os tratamentos. Para tratamentos experimentais mais longos, espere até 3-4 h antes da colheita e adicione 2 μL de um estoque de Baf concentrado 500x diretamente no meio.
      3. Misture agitando a placa imediatamente após a adição de Baf. Neste ponto, também é recomendável adicionar inibidores de sequestro macroautofágico como controles, por exemplo, 10 mM do inibidor de 3-fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K) 3-metil adenina (3MA) ou 10 μM do inibidor seletivo de PI3K classe III SAR-405.

2. Colheita de células e preparação para eletrodisrupção

1. No final do período de tratamento, aspirar o meio com sucção e adicionar 200 μL de solução de descolamento de células (pré-aquecida a 37 °C) a cada alvéolo. Incubar a 37 °C até que as células se desprendam (normalmente cerca de 5 min).
   nota: Enquanto 0,25% (p / v) de tripsina-EDTA pode ser usado em vez da solução de descolamento celular, esta última contém DNase, que ajuda a reduzir a viscosidade das células destacadas. Desde que o meio seja completamente aspirado, não é necessário lavar as células antes da adição de tripsina-EDTA ou solução de descolamento celular.
2. Adicionar 500 μL de PBS à temperatura ambiente (20-25 °C), pH 7,4, contendo 2% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA) a cada alvéolo, e ressuspender com a pipeta até que não sejam visíveis aglomerados de células. Transfira imediatamente a suspensão celular para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL em gelo.
   nota: Salvo indicação em contrário, execute todas as etapas subsequentes no gelo.
3. Sedimentar as células por centrifugação a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
4. Aspire completamente o sobrenadante (com sucção) para deixar os grânulos celulares o mais secos possível.
5. Adicione 400 μL de sacarose a 10% (p / v) (em H₂O ultrapuro) a cada tubo.

3. Eletroruptura da Membrana Plasmática e Separação de Frações de Células Sedimentáveis e Totais

1. Ressuspenda o pellet celular com uma pipeta para obter uma suspensão quase unicelular e transfira-o para uma cubeta de eletroporação de 4 mm.
   nota: A pipetagem para cima e para baixo ~ 10 a 15 vezes, usando uma ponta de pipeta de 100 a 1.000 μL, geralmente é suficiente.
2. Coloque a cubeta em um eletroporador de onda de decaimento exponencial e descarregue um único pulso elétrico a 800 V, 25 μF e 400 Ω; essas configurações produzem um pulso de ~ 8 ms de duração.
3. Use uma nova ponta de pipeta para transferir o disrupto celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 400 μL de solução de sacarose tamponada com fosfato gelado (100 mM de monofosfato de sódio, 2 mM de ditiotreitol (DTT), 2 mM de EDTA e 1,75% de sacarose, pH 7,5) e misture brevemente pipetando.
   1. Opcional: Para verificar a eletroruptura eficiente da membrana plasmática, misture 10 μL do rompimento de células diluídas da etapa 3.3 com 10 μL de azul de tripano a 0,4% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Transferir para uma câmara de contagem e verificar se a percentagem de células positivas para Azul de Trypan é de >99%.
      1. Deixe a amostra na câmara de contagem por 30 min à temperatura ambiente (20–25 °C) e verifique se a porcentagem de células positivas para Trypan Blue permaneceu >99%.
   2. Opcional: Para verificar se a eletroruptura não foi muito dura, ou seja, se não interrompeu as organelas intracelulares, execute as etapas 1.1 a 3.3 conforme descrito acima, mas use um material de partida maior (um poço de uma placa de 6 poços com uma camada de células confluentes de ~ 80%) e use 150 μL de sacarose a 10% na etapa 2.5 e 150 μL de solução de sacarose tamponada com fosfato sem DTT na etapa 3.3.
      1. Use uma pipeta para colocar cuidadosamente 200 μL da solução de ruptura celular diluída em cima de uma almofada de densidade de 1,2 mL de meio de gradiente de densidade de 8% (p / v) tamponado com fosfato (por exemplo, 8% Nycodenz, 50 mM de fosfato de sódio, 2,2% de sacarose, 1 mM de EDTA) em um tubo de centrífuga de 2 mL. Centrifugue a 20.000 x g por 45 min a 4 °C em uma microcentrífuga com função de modo suave (para aceleração e desaceleração suaves) e coloque cuidadosamente os tubos no gelo.
      2. Remova cuidadosamente 60 μL da fração superior de ~ 200 μL, certificando-se de não pegar nenhuma solução de meio de gradiente de densidade e transfira para um novo tubo de microcentrífuga.
         nota: Este deve conter citosol de pureza excepcional, denominado "seiva celular".
      3. Teste a pureza da fração obtida na etapa acima, realizando análises de western blot de proteínas contidas em organelas, usando técnicas padrão e géis de gradiente de 4 a 20%.
      4. Realizar, por exemplo, immunoblotting para catepsina B, citocromo c e proteína dissulfeto isomerase, para verificar se o choque elétrico na etapa 3.2 não interrompeu lisossomos, mitocôndrias ou retículo endoplasmático, respectivamente, e immunoblot para LDH para verificar a presença de uma proteína citosólica na seiva celular.
      5. Paralelamente, realizar immunoblotting em extratos de proteínas feitos a partir da solução de ruptura celular total para confirmar que os anticorpos usados podem detectar as proteínas contidas em organelas que estão sendo avaliadas.
4. Repita as etapas 3.1 a 3.3 para cada amostra.
5. Remova 550 μL de cada solução de ruptura celular diluída (obtida na etapa 3.3) para 2 mL de tubos de microcentrífuga contendo 900 μL de tampão de ressuspensão gelada (50 mM de monofosfato de sódio, 1 mM de DTT, 1 mM de EDTA e 5,9% de sacarose, pH 7,5) suplementado com 0,5% de BSA e 0,01% de Tween-20 e misture brevemente por pipetagem.
6. Centrifugue a 18.000 x g por 45 min a 4 °C para produzir pellets contendo "LDH sedimentado". Aspirar bem o sobrenadante (com sucção) para deixar os pellets o mais secos possível. Colocar as amostras num congelador a -80 °C.
7. Transferir 150 μL de cada solução diluída de ruptura celular (obtida no passo 3.3) para novos tubos e colocar as amostras num congelador a -80 °C. Use essas amostras para determinar os níveis de "LDH total" nas células.
   nota: Neste ponto, o experimento pode ser pausado pelo tempo que desejar.

4. Extração de LDH e Medição da Atividade Enzimática de LDH

1. Descongele as amostras de "LDH sedimentado" (da etapa 3.6) e "LDH total" (da etapa 3.7) no gelo.
2. Adicione 300 μL de tampão de ressuspensão gelado contendo 1,5% de Triton X-405 às amostras de "LDH total" (produzindo uma concentração final de Triton X-405 de 1%). Gire as amostras em um rolo em uma câmara fria (4–8 °C) por 30 min.
3. Adicione 750 μL de tampão de ressuspensão gelado com 1% de Triton X-405 às amostras de "LDH sedimentado" e ressuspenda os pellets com uma pipeta até que uma solução homogênea seja alcançada.
4. Centrifugue as amostras das etapas 4.2 e 4.3 a 18.000 x g por 5 min a 4 ° C para sedimentar detritos celulares não dissolvidos.
5. Misture 4 partes de imidazol frio a 65 mM (pH 7,5)/piruvato a 0,75 mM com uma parte de imidazol frio a 65 mM (pH 7,5)/1,8 mM de NADH para obter uma solução de trabalho estável durante pelo menos três semanas a 4 °C.
6. Misture 3–30 μL dos sobrenadantes da etapa 4.4 com 200 μL da solução de trabalho da etapa 4.5.
7. Determinar a quantidade de LDH medindo a atividade enzimática do LDH como o declínio da absorbância do dinucleotídeo de nicotinamida adenina (forma reduzida) (NADH) a 340 nm a 37 °C em comparação com um padrão com uma concentração conhecida de LDH. Realizar medições de absorbância até que a reação se aproxime da conclusão, ou seja, até que a absorbância a 340 nm não mude mais com o tempo.
   nota: Este é o método bioquímico clássico para medir a atividade do LDH. Embora o protocolo atual realize a reação a 37 °C, ela também pode ser realizada à temperatura ambiente (20–25 °C), o que é aconselhável se estiver fazendo espectrofotometria manual. O protocolo atual usa um instrumento robótico multi-analisador, que de forma automatizada mistura amostras com solução de trabalho em uma placa de 96 poços e mede a absorbância a 340 nm a 37 ° C a cada 20 s por 3 min. Em seguida, o software do instrumento calcula a concentração de LDH, expressa em Unidades (U)/L, comparando a inclinação das medições de absorbância ao longo do tempo em comparação com uma curva padrão obtida por meio de calibração com um padrão de concentração de LDH conhecido. A faixa linear de detecção por esta abordagem é de 30 a 1.500 U/L. Como alternativa, existe uma grande variedade de kits disponíveis comercialmente para medir LDH. Alguns deles baseiam-se no acoplamento da reação enzimática à geração de produtos colorimétricos ou fluorescentes, permitindo a detecção por outros meios que não a espectrofotometria UV, e com outras faixas lineares de detecção.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e 2 ml	Eppendorf	211-2130 e 211-2120
Placas de 12 poços	falcão	353043
Solução de descolamento de células Accumax	Tecnologias Celulares Inovadoras	Rolamento A7089	Mantenha as alíquotas a -20 °C por anos e na geladeira por alguns meses
Bafilomicina A1	Enzo	BML-CM110-0100	Dissolver em DMSO
Células BJ	ATCC	CRL-2522	Utilização na passagem <30
Albumina de soro bovino (BSA)	VWR	422361V
Câmara de contagem de Burker	Fisher Científico	139-658585
Lâminas de Câmara de Contagem de Células Condessa	ThermoFisher Scientfic	C10228
Contador de Células Automatizado Countess II	ThermoFisher Scientfic	AMQAX1000
Tampa de vidro para a câmara de contagem de Burker	Fisher Científico	139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26 poços, 15 μl, 13,3 x 8,7 cm (L x C)	Bio-Rad	3450034
TDT	Sigma-Aldrich	D0632
Solução salina balanceada de Earle (EBSS)	Gibco	Rolamento 24010-043	Conatains 0,1% de glicose
Edta	Sigma-Aldrich	E7889
Cubeta de eletroporação (4 mm)	Bio-Rad	1652088
Eletroporador de onda de decaimento exponencial	Aparelho BTX Harvard	EMC 630
Soro fetal bovino (FBS)	sigma	F7524	Concentração final de 10% em meio RPMI 1640
Células HEK293	ATCC	CRL-1573
Imidazol	Sigma-Aldrich	Rolamento 56750	Autoclave uma solução de 65 mM e mantenha na geladeira por meses
incubadora; Incubadora de CO2 de calor direto IR Autoflow	NuAire	NU-5510E
Reagente de transfecção de RNAiMAX de lipofectamina	ThermoFisher	13778150
Células LNCaP	ATCC	CRL-1740	Utilização na passagem <30
3-Metil Adenina (3MA)	Sigma-Aldrich	M9281	Armazene 100 mM em RPMI em -20 °C. Aqueça o estoque a 65 °C por 10 minutos e use na concentração final de 10 mM
Microcentrífuga refrigerada	Ciências da Vida Beckman Coulter	368831
Microcentrífuga refrigerada com função de modo suave	Eppendorf	Eppendorf 5417R
Cloridrato de MRT67307 (ULKi)	Sigma-Aldrich	SML0702	Inibe a atividade da quinase ULK. Dissolva em DMSO.
Instrumento multianalisador MaxMat	Erba Diagnósticos	PL-II
Células MCF7	ATCC	HTB-22
Nadh	Merck-Millipore	Rolamento 1.24644.001
Nycodenz	Eixo-Blindagem	1002424
Opti-MEM Meio de Soro Reduzido	ThermoFisher	31985062
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco	20012-019
Ponteiras de pipeta 3 (0,5-20 μl)	VWR	Rolamento 732-2223	Pontas de barreira Thermo Fischer ART
Ponteiras de pipeta (1-200 μl)	VWR	Rolamento 732-2207	Pontas de barreira Thermo Fischer ART
Ponteiras de pipeta (100-1000μl)	VWR	Rolamento 732-2355	Pontas de barreira Thermo Fischer ART
Pipetas	ThermoFisher	4701070	Kit Finnpipette F2 GLP
Poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	Rolamento P6407-10X5MG	Fazer uma solução-mãe de 1 mg/ml em H2O estéril. Esta solução é estável a -20 °C durante pelo menos 1 ano.
Piruvato	Merck-Millipore	1066190050
Células RPE-1 (hTERT RPE-1)	ATCC	CRL-4000
RPMI 1640	Gibco	Rolamento 21875-037
SAR-405	ApexBio	Rolamento A8883	Inibe a fosfoinositídeo 3-quinase classe III (PIK3C3). Dissolva em DMSO.
Controle Negativo de Seleção de Silenciador #1 (siCtrl)	ThermoFisher/Ambion	4390843
Silenciador Selecione siRNA direcionado a ATG9 (siATG9A)	ThermoFisher/Ambion	S35504
SiRNA direcionado ao FIP200 selecionado pelo silenciador (siFIP200)	ThermoFisher/Ambion	S18995
Silenciador Selecione o siRNA direcionado a ULK1 (siULK1)	ThermoFisher/Ambion	S15964
Silenciador Selecione siRNA direcionado a ULK2 (siULK2)	ThermoFisher/Ambion	S18705
SiRNA direcionado a GABARAP de seleção de silenciador (siGABARAP)	ThermoFisher/Ambion	S22362
Silenciador Selecione siRNA de segmentação de GABARAPL1 (siGABARAPL1)	ThermoFisher/Ambion	S24333
SiRNA de segmentação de GABARAPL2 Silencer Select (siGABARAPL2)	ThermoFisher/Ambion	S22387
Fosfato de sódio monobásico di-hidratado (NaH2PO4 • 2H2O)	Merck-Millipore	Rolamento 1.06580.1000
Fosfato de sódio dibásico di-hidratado (Na2HPO4 • 2H2O)	Prolabo	Rolamento 28014.291
sacarose	VWR	Rolamento 443816T	Concentração final de 10% em água; filtrar através de filtro de 0,45 μm e manter na geladeira por meses
Thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033	Inibe a bomba SERCA ER Ca2+. Dissolva em DMSO.
Tritão X-405	Sigma-Aldrich	X405	1% final
Mancha azul de tripano 0,4%	Sondas Moleculares	T10282
Tripsina-EDTA (0,25% p / v tripsina)	Gibco	Rolamento 25200-056
Interpolação-20	Sigma-Aldrich	Pág. 2287	0,01% final