1. Semeadura e Tratamento Celular
- Cultivar células aderentes em frascos de cultura de tecidos de 75 cm2 numa incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37 °C, utilizando o meio de cultura preferido para o tipo de célula em questão. Permita que as células cresçam até atingirem uma camada celular quase confluente.
nota: Use o meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) para LNCaP, HEK293, fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs), BJ, MCF-7 e células RPE-1.
- Lave as células com 3 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 37 °C, pH 7,4. Substitua o PBS por 3 mL de tripsina-etilenodiaminotetraacetato (EDTA) a 0,25% (p / v) e incube o frasco em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 a 37 ° C até que as células se desprendam (2–5 min).
- Ressuspenda as células destacadas com um meio de cultura de 7 mL contendo 10% de FBS. Misture uma alíquota de suspensão de células de 10 μL com 10 μL de azul de tripano a 0,4% em um tubo de microcentrífuga, usando uma ponta de pipeta de 0,5 a 20 μL. Use a mesma ponta de pipeta para encher imediatamente uma lâmina da câmara de contagem e conte as células em um contador de células automatizado.
- Prepare uma diluição adequada (veja a nota abaixo) da suspensão celular da etapa 1.1.2 usando um meio de cultura contendo 10% de FBS e semeie 1 mL da suspensão celular diluída em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços (área de superfície ~ 3,8 cm2) usando técnica asséptica. Permitir o crescimento em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 a 37 °C até que a densidade celular desejada seja atingida, por exemplo, 60–90% de confluência na colheita.
nota: A diluição apropriada da suspensão celular que dará a confluência celular desejada na colheita variará de tipo de célula para tipo de célula, bem como de acordo com a duração e o tipo de tratamentos experimentais. Assim, isso deve ser avaliado empiricamente em cada caso.
- Para experimentos que devem ser tratados e colhidos 2 dias após a semeadura, semeie 2,5 x 105 células LNCaP, HEK293 ou MCF-7, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ ou 1,5 x 105 células RPE-1 em cada poço da placa de 12 poços.
- Para células que aderem frouxamente, cubra as placas com o tipo de revestimento recomendado para o tipo de célula em questão. Para células LNCaP (e HEK293), use placas revestidas com poli-D-lisina (PDL).
- Para esse fim, adicione 500 μL de PDL a 2,5 μg / mL em H2O estéril a cada poço e incube as placas em um ambiente estéril por 30 min à temperatura ambiente (20–25 ° C). Remova o PDL com sucção e lave cada poço brevemente com 1 mL estéril H2O.
nota: Geralmente, a etapa 1.2.1 é feita sem nenhum tratamento experimental. No entanto, se estiver realizando RNAi, pode ser conveniente iniciar uma transfecção reversa com a semeadura.
- Realizar tratamentos experimentais em poços duplicados ou triplicados por condição.
- Por exemplo, trate as células com 50 nM do inibidor de mTOR Torin1, que geralmente é um indutor eficiente de sequestro autofágico, ou sujeite as células à falta aguda de soro e aminoácidos lavando as células com 1 mL de meio Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) sem aminoácidos e, posteriormente, incube as células em 1 mL de EBSS em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono (CO2) a 37 ° C.
- Deixe um conjunto de poços sem tratamento para definir os níveis de fundo de lactato desidrogenase sedimentável (LDH).
- Adicione uma quantidade saturada do inibidor pós-sequestro bafilomicina A1 (Baf) na ausência ou presença dos tratamentos experimentais, 3-4 h antes da colheita celular. Incubar as células em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 a 37 °C.
- Use 100 nM Baf para células LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 e RPE-1 e 10 nM Baf para MEFs.
- Para tratamentos experimentais que têm uma duração de apenas 3 a 4 h (como os exemplificados na etapa 1.3.1 normalmente), adicione Baf simultaneamente com os tratamentos. Para tratamentos experimentais mais longos, espere até 3-4 h antes da colheita e adicione 2 μL de um estoque de Baf concentrado 500x diretamente no meio.
- Misture agitando a placa imediatamente após a adição de Baf. Neste ponto, também é recomendável adicionar inibidores de sequestro macroautofágico como controles, por exemplo, 10 mM do inibidor de 3-fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K) 3-metil adenina (3MA) ou 10 μM do inibidor seletivo de PI3K classe III SAR-405.
2. Colheita de células e preparação para eletrodisrupção
- No final do período de tratamento, aspirar o meio com sucção e adicionar 200 μL de solução de descolamento de células (pré-aquecida a 37 °C) a cada alvéolo. Incubar a 37 °C até que as células se desprendam (normalmente cerca de 5 min).
nota: Enquanto 0,25% (p / v) de tripsina-EDTA pode ser usado em vez da solução de descolamento celular, esta última contém DNase, que ajuda a reduzir a viscosidade das células destacadas. Desde que o meio seja completamente aspirado, não é necessário lavar as células antes da adição de tripsina-EDTA ou solução de descolamento celular.
- Adicionar 500 μL de PBS à temperatura ambiente (20-25 °C), pH 7,4, contendo 2% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA) a cada alvéolo, e ressuspender com a pipeta até que não sejam visíveis aglomerados de células. Transfira imediatamente a suspensão celular para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL em gelo.
nota: Salvo indicação em contrário, execute todas as etapas subsequentes no gelo.
- Sedimentar as células por centrifugação a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
- Aspire completamente o sobrenadante (com sucção) para deixar os grânulos celulares o mais secos possível.
- Adicione 400 μL de sacarose a 10% (p / v) (em H2O ultrapuro) a cada tubo.
3. Eletroruptura da Membrana Plasmática e Separação de Frações de Células Sedimentáveis e Totais
- Ressuspenda o pellet celular com uma pipeta para obter uma suspensão quase unicelular e transfira-o para uma cubeta de eletroporação de 4 mm.
nota: A pipetagem para cima e para baixo ~ 10 a 15 vezes, usando uma ponta de pipeta de 100 a 1.000 μL, geralmente é suficiente.
- Coloque a cubeta em um eletroporador de onda de decaimento exponencial e descarregue um único pulso elétrico a 800 V, 25 μF e 400 Ω; essas configurações produzem um pulso de ~ 8 ms de duração.
- Use uma nova ponta de pipeta para transferir o disrupto celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 400 μL de solução de sacarose tamponada com fosfato gelado (100 mM de monofosfato de sódio, 2 mM de ditiotreitol (DTT), 2 mM de EDTA e 1,75% de sacarose, pH 7,5) e misture brevemente pipetando.
- Opcional: Para verificar a eletroruptura eficiente da membrana plasmática, misture 10 μL do rompimento de células diluídas da etapa 3.3 com 10 μL de azul de tripano a 0,4% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Transferir para uma câmara de contagem e verificar se a percentagem de células positivas para Azul de Trypan é de >99%.
- Deixe a amostra na câmara de contagem por 30 min à temperatura ambiente (20–25 °C) e verifique se a porcentagem de células positivas para Trypan Blue permaneceu >99%.
- Opcional: Para verificar se a eletroruptura não foi muito dura, ou seja, se não interrompeu as organelas intracelulares, execute as etapas 1.1 a 3.3 conforme descrito acima, mas use um material de partida maior (um poço de uma placa de 6 poços com uma camada de células confluentes de ~ 80%) e use 150 μL de sacarose a 10% na etapa 2.5 e 150 μL de solução de sacarose tamponada com fosfato sem DTT na etapa 3.3.
- Use uma pipeta para colocar cuidadosamente 200 μL da solução de ruptura celular diluída em cima de uma almofada de densidade de 1,2 mL de meio de gradiente de densidade de 8% (p / v) tamponado com fosfato (por exemplo, 8% Nycodenz, 50 mM de fosfato de sódio, 2,2% de sacarose, 1 mM de EDTA) em um tubo de centrífuga de 2 mL. Centrifugue a 20.000 x g por 45 min a 4 °C em uma microcentrífuga com função de modo suave (para aceleração e desaceleração suaves) e coloque cuidadosamente os tubos no gelo.
- Remova cuidadosamente 60 μL da fração superior de ~ 200 μL, certificando-se de não pegar nenhuma solução de meio de gradiente de densidade e transfira para um novo tubo de microcentrífuga.
nota: Este deve conter citosol de pureza excepcional, denominado "seiva celular".
- Teste a pureza da fração obtida na etapa acima, realizando análises de western blot de proteínas contidas em organelas, usando técnicas padrão e géis de gradiente de 4 a 20%.
- Realizar, por exemplo, immunoblotting para catepsina B, citocromo c e proteína dissulfeto isomerase, para verificar se o choque elétrico na etapa 3.2 não interrompeu lisossomos, mitocôndrias ou retículo endoplasmático, respectivamente, e immunoblot para LDH para verificar a presença de uma proteína citosólica na seiva celular.
- Paralelamente, realizar immunoblotting em extratos de proteínas feitos a partir da solução de ruptura celular total para confirmar que os anticorpos usados podem detectar as proteínas contidas em organelas que estão sendo avaliadas.
- Repita as etapas 3.1 a 3.3 para cada amostra.
- Remova 550 μL de cada solução de ruptura celular diluída (obtida na etapa 3.3) para 2 mL de tubos de microcentrífuga contendo 900 μL de tampão de ressuspensão gelada (50 mM de monofosfato de sódio, 1 mM de DTT, 1 mM de EDTA e 5,9% de sacarose, pH 7,5) suplementado com 0,5% de BSA e 0,01% de Tween-20 e misture brevemente por pipetagem.
- Centrifugue a 18.000 x g por 45 min a 4 °C para produzir pellets contendo "LDH sedimentado". Aspirar bem o sobrenadante (com sucção) para deixar os pellets o mais secos possível. Colocar as amostras num congelador a -80 °C.
- Transferir 150 μL de cada solução diluída de ruptura celular (obtida no passo 3.3) para novos tubos e colocar as amostras num congelador a -80 °C. Use essas amostras para determinar os níveis de "LDH total" nas células.
nota: Neste ponto, o experimento pode ser pausado pelo tempo que desejar.
4. Extração de LDH e Medição da Atividade Enzimática de LDH
- Descongele as amostras de "LDH sedimentado" (da etapa 3.6) e "LDH total" (da etapa 3.7) no gelo.
- Adicione 300 μL de tampão de ressuspensão gelado contendo 1,5% de Triton X-405 às amostras de "LDH total" (produzindo uma concentração final de Triton X-405 de 1%). Gire as amostras em um rolo em uma câmara fria (4–8 °C) por 30 min.
- Adicione 750 μL de tampão de ressuspensão gelado com 1% de Triton X-405 às amostras de "LDH sedimentado" e ressuspenda os pellets com uma pipeta até que uma solução homogênea seja alcançada.
- Centrifugue as amostras das etapas 4.2 e 4.3 a 18.000 x g por 5 min a 4 ° C para sedimentar detritos celulares não dissolvidos.
- Misture 4 partes de imidazol frio a 65 mM (pH 7,5)/piruvato a 0,75 mM com uma parte de imidazol frio a 65 mM (pH 7,5)/1,8 mM de NADH para obter uma solução de trabalho estável durante pelo menos três semanas a 4 °C.
- Misture 3–30 μL dos sobrenadantes da etapa 4.4 com 200 μL da solução de trabalho da etapa 4.5.
- Determinar a quantidade de LDH medindo a atividade enzimática do LDH como o declínio da absorbância do dinucleotídeo de nicotinamida adenina (forma reduzida) (NADH) a 340 nm a 37 °C em comparação com um padrão com uma concentração conhecida de LDH. Realizar medições de absorbância até que a reação se aproxime da conclusão, ou seja, até que a absorbância a 340 nm não mude mais com o tempo.
nota: Este é o método bioquímico clássico para medir a atividade do LDH. Embora o protocolo atual realize a reação a 37 °C, ela também pode ser realizada à temperatura ambiente (20–25 °C), o que é aconselhável se estiver fazendo espectrofotometria manual. O protocolo atual usa um instrumento robótico multi-analisador, que de forma automatizada mistura amostras com solução de trabalho em uma placa de 96 poços e mede a absorbância a 340 nm a 37 ° C a cada 20 s por 3 min. Em seguida, o software do instrumento calcula a concentração de LDH, expressa em Unidades (U)/L, comparando a inclinação das medições de absorbância ao longo do tempo em comparação com uma curva padrão obtida por meio de calibração com um padrão de concentração de LDH conhecido. A faixa linear de detecção por esta abordagem é de 30 a 1.500 U/L. Como alternativa, existe uma grande variedade de kits disponíveis comercialmente para medir LDH. Alguns deles baseiam-se no acoplamento da reação enzimática à geração de produtos colorimétricos ou fluorescentes, permitindo a detecção por outros meios que não a espectrofotometria UV, e com outras faixas lineares de detecção.
