1. Condições de cultura para proteína fluorescente verde que expressa M. tuberculosis mc26206 (Mtb-GFP)
NOTA: A cepa auxotrófica derivada de M. tuberculosis H37Rv mc26206 (ΔpanCD, ΔleuCD) transformada com o gfp (proteína fluorescente verde) expressando o plasmídeo pMN437 é usado em todo este protocolo. É possível substituir a cepa Mtb-GFP por cepas de tipo selvagem que não expressam gfp para facilitar o acesso da cepa para os pesquisadores. No entanto, a expressão de gfp é desejável para permitir a confirmação visual da fagocitose e a formação de agregados de Mtb/macrófagos. Para armazenamento de longo prazo, o Mtb-GFP foi congelado a -80 °C em meio 7H9 completo (descrito na etapa 1.1) suplementado com 20% de glicerol.
- Prepare o meio completo de Mtb-GFP (7H9-C) suplementando o meio 7H9 com 10% de Middlebrook OADC (Oleic Albumin Dextrose Catalase), 0,02% de tiloxapol, 24 μg / mL de ácido D-pantotênico, 50 μg / mL de L-leucina e 50 μg / mL de higromicina B.
- Descongelar um frasco para injetáveis de Mtb-GFP e adicionar 10 ml de 7H9-C num balão de PETG de fundo quadrado de 30 ml.
- Incubar a 37 °C num agitador rotativo (50 rpm). Faça medições de densidade óptica (OD600) a cada poucos dias até que OD600 atinja 1,0 (aproximadamente 5-8 dias).
- Diluir e cultura de passagem conforme necessário para manter um OD600 entre 0,2-1,0.
- Para infecção, use uma cultura estabelecida de Mtb-GFP dentro da fase de crescimento logarítmico (OD600 de 0,6-1). Para evitar culturas grumosas, sonicar o frasco de cultura Mtb em banho-maria (pulsos de 130 W; 3 x 5 s) uma ou duas vezes por semana.
2. Condições de cultura para células THP-1
- Prepare o meio celular THP-1 completo (RPMI-C) suplementando o meio RPMI 1640 com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor, 2 mM de L-glutamina e 10 mM de HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico).
- Incubar as células num balão T-75 a 37 °C numa atmosfera humidificada de CO2 a 5%.
- Conte as células usando um hemocitômetro ou citometria de fluxo a cada dois dias e mantenha as células THP-1 em uma densidade entre 0,1 a 0,6 milhão por mL.
3. Protocolo de infecção para gerar estruturas agregadas de Mtb/macrófagos
- Preparação de células THP-1 (por placa de 96 poços)
- Centrifugue 7 x 106 células THP-1 a 250 x g por 5 min. Ressuspenda em 7 mL de RPMI-C.
- Preparação para Mtb-GFP
- Centrífuga 2,8 x 108 Mtb-GFP a 3.200 x g por 5 min em uma centrífuga de balde oscilante usando uma conversão de OD600 1,0 = 3 x 108 bactérias/mL.
- Lave uma vez com RPMI-C e centrifugue como na etapa 3.2.1.
- Ressuspenda em 7 mL de RPMI-C e vórtice por 10 s.
- Infecção
NOTA: Consulte a Figura 1 para obter o modelo.
- Preparar uma placa de 96 poços adicionando 200 μL de água estéril nas linhas A e H e nas colunas 1 e 12 para uma borda de água para evitar a evaporação do meio de cultura.
- Adicione 200 μL de RPMI-C à coluna 2 (B2 a G2) para o controle de fundo (em branco).
- Para infectar, adicione a suspensão de Mtb-GFP (etapa 3.2) à suspensão de células THP-1 (etapa 3.1) e misture bem por pipetagem. A densidade celular final do THP-1 é de 5 x10,5 por mL e a multiplicidade correspondente de infecção é de 40.
- Despeje a suspensão THP-1/Mtb-GFP em um reservatório de 25 mL.
- Adicione 200 μL de suspensão THP-1/Mtb-GFP a todos os 96 poços restantes (B3 a G11) usando uma pipeta multicanal.
nota: Se estiver trabalhando com várias placas de 96 poços, ressuspenda regularmente a suspensão THP-1/Mtb restante no reservatório para garantir que uma mistura uniforme seja adicionada a cada poço.
- Incubar a 37 °C com 5% de CO2 por 7 a 10 dias.
- Troque a mídia a cada 2 dias removendo lentamente 100 μL de mídia gasta do topo de cada poço e adicionando suavemente 100 μL de RPMI-C pré-aquecido usando uma pipeta multicanal. Não ressuspenda os poços e perturbe os agregados de Mtb/macrófagos no fundo dos poços.
- Examine visualmente os poços por microscopia de fluorescência (objetiva de 4-10X) diariamente, observando o tamanho dos agregados de Mtb / macrófagos. No dia 7-10, os agregados de Mtb/macrófagos devem ser suficientemente grandes (consulte a Figura 2 para referência) para prosseguir com o teste de eficácia do medicamento (Seção 4).
- Se desejar, capture imagens dos 96 poços usando um sistema automatizado de imagem celular equipado com conjuntos de filtros de campo claro e GFP para documentar a formação de agregados de Mtb/macrófagos.
nota: Se os usuários não tiverem acesso a um sistema de imagem automatizado, as imagens de poços representativos podem ser obtidas usando qualquer microscópio apropriado com recursos de GFP e campo claro.
4. Ensaio de inibição do crescimento para avaliar a eficácia do medicamento contra Mtb derivado de agregados de Mtb/macrófagos
- Preparo de fármacos (condições triplicadas para dois fármacos)
NOTA: Consulte a Figura 1A para obter o modelo.
- Em uma placa separada de 96 poços, adicione 125 μL de meio 7H9-C a B2 até G10.
- Prepare dois medicamentos com o dobro da concentração final desejada mais alta em 1 mL de 7H9-C para contabilizar a diluição na etapa 4.2.4.
- Adicione 250 μL de cada medicamento aos poços B11-C11-D11 e E11-F11-G11, respectivamente, para tratamentos triplicados.
- Usando uma pipeta multicanal, dilua em série os medicamentos de teste duas vezes, movendo 125 μL de B11-G11 para B10-G10. Misture pipetando 5 vezes em cada etapa.
- Continue a mover 125 μL de coluna para coluna (da direita para a esquerda) através da placa e pare após a coluna 4.
- Depois de misturar a coluna 4, descarte 125 μL em um recipiente de lixo. As colunas 2 e 3 não devem conter nenhum medicamento para permitir o uso como pano de fundo (em branco) e controles positivos de crescimento.
nota: Como alternativa, siga o modelo na Figura 1B para testar bibliotecas de medicamentos. Cada placa de 96 poços pode acomodar 58 medicamentos em uma única concentração. Prepare esta placa de medicamento usando o dobro da concentração final desejada, pois ela será diluída ao meio na etapa 4.2.4.
- Tratamento medicamentoso:
- Recupere a placa de 96 poços contendo os macrófagos infectados com Mtb (agregados de Mtb/macrófagos).
- Decantar cuidadosamente todos os alvéolos relevantes (B2 a G11) com uma pipeta multicanal. Execute isso em duas etapas: primeiro, remova 150 μL sem inclinar a placa e, em seguida, remova o meio restante (~ 50 μL) inclinando a placa e inserindo a ponta da pipeta na borda inferior do poço. Como os agregados de Mtb/macrófagos são aderentes ao fundo do poço, nenhum material deve ser perdido.
- Adicione suavemente 100 μL de meio 7H9-C a todos os poços relevantes (B2 a G11) da placa que contém os agregados de Mtb/macrófagos.
- Usando uma pipeta multicanal, transfira 100 μL da placa de 96 poços contendo o medicamento (etapa 4.1) para os poços correspondentes da placa de infecção.
- Colocar num saco fechado e incubar durante 3 dias a 37 °C.
5. Quantificação da eficácia do medicamento usando o ensaio de microtitulação de resazurina
- Prepare a solução-mãe de resazurina a uma concentração final de 0,8 mg / mL em H2O. Filtre através de uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) de tamanho de poro de 0,22 μm para esterilização.
- Prepare a solução de trabalho de resazurina misturando a solução-mãe de resazurina, H2O e Tween-80 (solução a 20% em H2O) na proporção de 2:1:1. As concentrações finais são 0,4 mg/mL de resazurina e 5% de Tween-80.
- Usando um leitor de placas, configure um programa para ler a fluorescência a 530 nm de excitação e emissão de 590 nm a cada 30 minutos por 24 h a 37 ° C. Pré-aqueça o leitor de placas a 37 ° C.
- Adicione 20 μL de solução de trabalho de resazurina a todos os poços relevantes (B2 a G11) da placa tratada com medicamento (etapa 4.11) usando uma pipeta multicanal.
- Coloque a placa no leitor de placas e inicie o programa configurado no passo 5.3.
nota: Para facilitar o processamento de grandes volumes de placas de ensaio, é suficiente desenvolver o ensaio em uma incubadora a 37 °C e realizar leituras de fluorescência únicas a cada 24 h. Isso também se aplica a usuários que não têm acesso a um leitor de placas com recursos cinéticos e de incubação.
