Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Dia 1
NOTA: Execute todas as etapas descritas abaixo em um gabinete de biossegurança de fluxo laminar estéril usado para cultura de tecidos em um laboratório BSL-2.
- Descongele as amostras de soro à temperatura ambiente e transfira 100 μL de cada amostra de soro para um tubo estéril. Inative o calor por 30 min a 56°C em banho-maria ou termomisturador com temperatura ajustável. Faça diluições seriadas de 10 vezes da amostra de soro variando de 1:1 a 1:1.000 usando RPMI-10 frio (RPMI com 10% de soro fetal bovino).
- Transfira 10 μL de soro diluído em série sample para cada poço de uma placa estéril de fundo em V de 96 poços. Inclua dois conjuntos de poços de controle, RPMI-10 apenas com RVPs e sem amostra de soro e RPMI-10 apenas sem RVPs e sem amostra de soro. Configure cada amostra de soro e controles RPMI-10 em triplicatas.
- Remova os RVPs Dengue-1, 2, 3 e 4 do freezer a -80 °C e descongele-os em banho-maria a 37 °C. Transfira os RVPs descongelados imediatamente para o gelo. Obtenha aproximadamente 170 μL de RVPs para cada amostra de soro (10 μL de RVPs x 3 poços para cada diluição de soro (1:1, 1:10, 1:100, 1:1.000) e 10 μL de RVPs x 3 poços para cada um dos RPMI-10 com apenas poços de controle RVP).
- Pipete 10 μL de RVPs em cada poço da placa de fundo em V de 96 poços contendo a amostra de soro e para o RPMI-10 com RVPs (sem soro) Não adicione RVPs apenas aos poços RPMI-10 (sem amostra de soro e sem RVP). Misture bem pipetando para cima e para baixo 5 a 10 vezes. Adicione 10 μL de RPMI-10 frio em vez de RVPs a cada RPMI-10 frio apenas (sem amostra de soro e sem RVP) poços de controle.
- Transfira a placa de fundo em V de 96 poços para uma incubadora e incube a placa por 1 hora a 37 ° C na presença de 5% de CO2. Enquanto a placa de fundo em V de 96 poços está incubando, limpe a superfície do gabinete de biossegurança com etanol a 70% e deixe a luz UV funcionar por 15 minutos.
- Remova um frasco T75 totalmente confluente de células K562 da incubadora, misture bem as células usando uma pipeta estéril de 5 mL e transfira 5 mL de células para um tubo cônico estéril de 15 mL.
nota: As células K562 são mantidas em RPMI-10 e subcultivadas a 1 x 106/mL.
- Conte o número de células removendo 10 μL de células do tubo cônico estéril de 15 mL e misture com 10 μL de azul de tripano. Conte as células usando um hemocitômetro para determinar o número total de células no tubo cônico de 15 mL.
- Centrifugue os 15 mL cônicos com células a ~ 1.200 x g por 10 minutos, transvase o sobrenadante e ressuspenda as células em RPMI-10 quente a uma concentração de 80.000 células / 30 μL de meio (2,66 x 106 células / mL).
- Remova a placa de fundo em V de 96 poços da incubadora (etapa 1.6), transfira 30 μL de células K562 para cada poço da placa de fundo em V de 96 poços e misture bem pipetando para cima e para baixo de 5 a 10 vezes. Transfira a placa de fundo em V de 96 poços para uma incubadora e incube a placa por 1 hora a 37 ° C na presença de 5% de CO2.
- Após incubar por 1 h, remova a placa de fundo em V de 96 poços da incubadora e centrifugue a ~ 1.200 x g por 5 minutos. Após a centrifugação, decantar o meio dos poços virando a placa de cabeça para baixo em um recipiente contendo 10% de água sanitária.
- Lave as células em cada poço ressuspendendo-as em 125 μL de RPMI-10 quente, misture bem com uma pipeta e centrifugue a placa a ~ 1.200 x g por 5 min. Transvase a mídia virando a placa de cabeça para baixo em um recipiente contendo 10% de alvejante. Repita esta etapa de lavagem duas vezes.
- Após a lavagem, adicione 100 μL de RPMI-10 quente a cada poço, misture para cima e para baixo com a pipeta e incube a placa por 48 h a 37 ° C na presença de 5% de CO2.
2. Dia 3
- Remova a placa de fundo em V de 96 poços contendo 100 μL de células e meio/poço da incubadora e mova-a para um gabinete de biossegurança. Usando uma pipeta multicanal, misture o conteúdo de cada poço e transfira as células e o meio para uma placa de fundo em U de 96 poços ou tubos de polipropileno pré-rotulados de 5 mL.
- Enxágue cada poço na placa de fundo em V de 96 poços com 100 μL de paraformaldeído a 1% (PFA) em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) e transfira para os respectivos poços na placa de fundo em U de 96 poços ou tubos de polipropileno de 5 mL rotulados da etapa 2.1 para produzir uma concentração final de 0.5% de PFA/poço ou tubo. Misture bem usando uma pipeta multicanal, cubra a placa com papel alumínio e deixe descansar na incubadora por 30 minutos para fixar as células.
- Prepare o citômetro de fluxo (consulte a Tabela de Materiais, por exemplo) executando células K562 não coradas para calibrar a dispersão lateral e direta junto com as configurações de fluorescência. O único canal de fluorescência necessário é FL1, pois GFP é a única fluorescência emitida pelas células. Adquira ~30.000–50.000 células de cada amostra.
nota: Qualquer citômetro de fluxo capaz de ler uma única fluorescência pode ser usado para adquirir os dados, pois as células infectadas com RVPs emitirão apenas fluorescência verde devido à presença de GFP e nenhum outro canal de fluorescência será necessário.
3. Análise dos dados
- Analise os dados adquiridos no citômetro de fluxo usando qualquer software de análise de citometria de fluxo (consulte a Tabela de Materiais).
- Defina a primeira porta com base em FSC-A (dispersão direta – área) versus FSC-H (dispersão direta – altura) para incluir células únicas e excluir dublês autofluorescentes da análise. Em seguida, bloqueie as células controladas por singleto com base em SSC-A (dispersão lateral - área) vs FSC-A para excluir quaisquer detritos autofluorescentes.
- Analise células controladas SSC-A vs FSC-A para a expressão de GFP com base em SSC-A vs GFP-A. Determine a porcentagem de células GFP+ para cada diluição do soro e amostras de controle, definindo uma porta ao redor das células GFP+.
- Determine a porcentagem média de células GFP+ para cada diluição de amostra de soro e poços de controle, dividindo a porcentagem total de células GFP+ nos poços triplicados por 3.
- Calcule o aumento da dobra da infecção dividindo a porcentagem média de células GFP + nas amostras de soro para cada diluição pela porcentagem média de células GFP + no RPMI-10 com RVPs (sem amostra de soro)
- Representar graficamente o realce de dobra (eixo y) versus diluição (eixo x) e realizar análise estatística usando ANOVA seguida do teste post-hoc de Tukey para comparações múltiplas.
