1. Triagem de potenciais nanoinibidores de TLR4 usando as células repórter
NOTA: Como a sinalização TLR4 utiliza ambas as vias dependentes de TRIF terrestres dependentes de MyD88, ela é selecionada como o alvo principal para abranger uma ampla gama de vias de sinalização TLR. As células repórter THP-1-XBlue são usadas para examinar principalmente a ativação de NF-κB / AP-1, enquanto as células THP-1-Dual são para ativação de IRF a partir da transdução de sinal dependente de TRIF.
- Identifique a dose ideal de LPS gerando uma curva dose-resposta antes da triagem.
- Diluir a solução de LPS de trabalho até uma concentração final de 0,01 - 100 ng/ml em meio R10 (fazer a diluição à escala log10). Disponha o desenho da placa e faça a diluição numa placa de cultura de fundo redondo de 96 poços. Certifique-se de que cada alvéolo tem um mínimo de 110 μL de solução após a diluição.
- Remova cuidadosamente o meio de cultura da placa semeada por células usando um aspirador a vácuo.
- Transferir o LPS contendo o meio R10 preparado na placa de diluição (1.1.1) para a placa de cultura, de acordo com a disposição das amostras. Incubar a placa a 37 °C (numa incubadora de cultura de células) durante 24 h.
- Em 24 h, transfira cuidadosamente os sobrenadantes (80 μL / poço) para uma nova placa de fundo redondo de 96 poços. Realize o ensaio de luminescência colorimétrica e/ou luciferase nessas soluções imediatamente ou armazene-as a 4 °C (várias horas) ou -20 °C (dias) antes do desenvolvimento do ensaio.
nota: O design do layout da placa deve ser simples e claro para experimento e análise de dados. Para cada condição, devem ser consideradas 2-4 réplicas. Sempre inclua um grupo de controle negativo (LPS nulo). Recomenda-se o uso de células THP-1-XBlue para ativação de NF-κB / AP-1, pois as células duplas têm um fundo relativamente alto de ativação de NF-κB / AP-1 após serem diferenciadas em macrófagos. No entanto, é viável usar as células duplas para relatar a ativação de NF-κB/AP-1 e IRF.
- Desenvolver o ensaio colorimétrico para a ativação de NF-κB/AP-1 e o ensaio de luminescência de luciferase para ativação de IRF.
- Para avaliar a ativação do NF-κB/AP-1, transfira 20 μL de sobrenadante de cada amostra para uma nova placa de cultura de fundo plano de 96 poços e adicione 180 μL de solução de substrato SEAP pré-aquecida em cada poço. Incubar a placa a 37 °C durante 1 - 2 h para permitir o desenvolvimento da cor (rosa a azul escuro). Colete a absorção a 655 nm em um leitor de placas.
cuidado: O tempo de incubação pode variar com base no desenvolvimento da cor (30 min até a incubação noturna). Recomenda-se esperar até que a densidade óptica (OD) da cor mais escura atinja acima de 1, evitando a saturação do desenvolvimento da cor (OD >3).
- Para a análise da ativação do IRF, transfira 10 μL de sobrenadante de cada amostra para uma placa branca transparente de fundo plano de 96 poços. Adicionar a solução de luciferase (50 μL) e coletar imediatamente o poço de luminescência por poço.
nota: É altamente recomendável usar um leitor de placas de luminescência com função de autoinjeção para garantir consistência na leitura de luminescência de poço a poço e de placa a placa. Se as soluções de substrato forem injetadas manualmente, certifique-se de um tempo de incubação consistente e configuração de leitura para cada poço.
- Realize o ensaio de triagem em vários híbridos peptídeo-GNP com estimulação LPS de 10 ng/mL (com base em 1,1). Siga o mesmo procedimento em 1.2 para o desenvolvimento do ensaio repórter.
- Concentrar os híbridos peptídeo-GNP a 200 nM num meio R10, utilizando o método de centrifugação. Centrifugue 20 volumes da solução híbrida (10 nM) a 18.000 x g por 30 min e descarte cuidadosamente os sobrenadantes. Recolher os híbridos (no fundo do tubo) para um tubo, lavá-los com PBS duas vezes e ressuspender os híbridos num volume do meio R10.
- Misturar volumes iguais dos híbridos concentrados e do LPS (20 ng/ml) contendo o meio R10 para obter uma concentração final dos híbridos e do LPS de 100 nM e 10 ng/ml, respectivamente.
- Retirar o meio de cultura da placa cultivada e adicionar 100 μl da solução misturada em cada alvéolo (3 repetições para cada condição); incluir um controlo negativo (apenas meio) e um controlo LPS (10 ng/ml de LPS sem híbridos).
- Após 24 h de incubação a 37 °C, transferir o meio de cada alvéolo para um tubo e centrifugar os tubos a 18.000 x g, 4 °C durante 30 min. Recolher os sobrenadantes (50-80 μL/tubo) para uma placa de fundo redondo de 96 poços e realizar o ensaio repórter conforme descrito em 3.2.
cuidado: Ao descartar os sobrenadantes após centrifugação, não agitar os híbridos no fundo do tubo.
nota: A centrifugação na etapa 1.3.4 é muito importante para remover os híbridos de nanopartículas não internalizados do meio de cultura e pode evitar a interferência dos híbridos nas leituras colorimétricas/luminescentes. Isso ocorre porque as nanopartículas de ouro podem absorver amplos comprimentos de onda de luz, dependendo de seu tamanho e aglomeração.
2. Validando o efeito inibitório dos candidatos potenciais
NOTA: Para confirmar o efeito inibitório dos potenciais candidatos da triagem, duas abordagens são empregadas. Uma é examinar as respostas à dose dos estimulantes (LPS) em uma concentração híbrida fixa (ou vice-versa); a outra é observar diretamente a inibição dos sinais NF-κB/AP-1 e IRF3 via immunoblotting.
- Na abordagem um, realizar o ensaio repórter com 100 nM dos híbridos de chumbo e duas concentrações de LPS a 1 ng/mL e 10 ng/mL seguindo os mesmos procedimentos descritos em 1.3. Inclua um híbrido inativo (com base nos resultados da triagem) como um controle híbrido para comparação.
- Para a abordagem de immunoblotting, siga os procedimentos experimentais padrão.
- Cultive células THP-1 em meio R10, semeie as células em uma placa de cultura de 12 poços (2 x 106 células/poço) e diferencie-as em macrófagos tratando as células com 50 ng/mL de PMA por 24 h seguido de repouso por 2 dias.
- Após a diferenciação celular, estimular as células com 10 ng/mL de LPS com/sem os híbridos (100 nM) ao longo do tempo (até 4 h). Em vários pontos de tempo (0, 5, 15, 30, 60, 120 e 240 min), prepare os lisados celulares para immunoblotting. Inclua um híbrido inativo como controle.
- Sonde os sinais de IκBα, p65 fosforilada e IRF3 fosforilada para examinar o efeito inibitório dos híbridos principais na ativação de NF-κB e IRF3. Sonde os sinais de β-actina e IRF3 total como controles internos.
nota: A transdução de sinal geralmente ocorre muito mais rápido (em poucas horas) do que a expressão das enzimas repórter SEAP e luciferase (24 h). É altamente recomendável também realizar um ensaio de viabilidade dos híbridos testados em 24 h como outro método de validação.
3. Avaliando a especificidade da TLR
NOTA: Para investigar a especificidade TLR do híbrido peptídeo principal-GNP, outras vias de sinalização TLR são testadas, incluindo TLR2, TLR3 e TLR5. TLR7, 8 e 9 são excluídos porque os macrófagos derivados de THP-1 não respondem bem à estimulação desses TLRs devido à falta de expressão de TLR7, 8 e 9 em macrófagos.
- Teste várias concentrações (1 ng/mL a 25 μg/mL) dos ligantes específicos para TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poli I:C) e TLR5 (flagelina) em ambos os macrófagos derivados de células repórter para obter a concentração ideal seguindo o mesmo procedimento em 1.1 e 1.2.
- Tratar as células com as misturas do híbrido de chumbo (100 nM) e de cada ligante TLR na concentração obtida a partir de 3.1 para avaliar a especificidade inibitória do híbrido de chumbo de acordo com o procedimento experimental descrito no ponto 1.3. Inclua o híbrido inativo como um controle para comparação.
