Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Isolamento de órgãos
NOTA: O vírus não é estável à temperatura ambiente (RT), portanto, o número de animais colhidos de uma só vez deve ser planejado cuidadosamente para preservar os títulos virais.
- Infecte camundongos usando a dose e a via escolhidas, com base no fenótipo necessário. Para este protocolo, infecte camundongos C57BL/6 deficientes em receptor de interferon tipo I (Ifnar1-/-) de 8 a 10 semanas de idade.
- Anestesiar camundongos Ifnar1-/- com um coquetel de cetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Teste o reflexo do pedal com uma pinça firme do dedo do pé para confirmar a anestesia. Administre 1 x 105 unidades formadoras de foco (FFU) de ZIKV em 50 μL por via subcutânea (SC) através da almofada do pé.
- Preparar todos os materiais necessários para a colheita no dia anterior 2 tesouras, pinças e 20 mL de etanol a 70% (EtOH) em uma cônica de 50 mL para desinfecção das ferramentas.
- Prepare seringas e agulhas: uma seringa de 20 mL para perfusão, agulhas de 23 G (aproximadamente 1 por gaiola) e uma seringa de 1 mL com agulhas de 25 G (1 por 3-5 camundongos). Antes de pesar os tubos, adicione esferas de aço (no capô) aos tubos de tampa de rosca O-ring de 1.5 mL (um para cada órgão). Os tubos precisam ser apropriados para homogeneização.
- Preparar no dia da colheita os materiais necessários para a perfusão e congelamento de órgãos.
- Encha um balde de gelo com gelo seco e 70% de EtOH para fazer um banho de gelo. Prepare solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) assumindo que 25-30 mL por camundongo de PBS para cada perfusão são necessários 5-10 mL para a medula espinhal). Obtenha anestesia, um coquetel de cetamina e xilazina e assuma 300 μL por camundongo. Coloque todos os materiais e quaisquer tubos adicionais necessários para citometria de fluxo, etc., em um recipiente secundário para transportar para a instalação animal.
- Siga todos os procedimentos necessários para a entrada, incluindo colocar e retirar equipamentos de proteção individual durante a entrada e saída do biotério.
cuidado: Todos os procedimentos devem ser realizados em um gabinete de biossegurança certificado dentro de uma instalação de laboratório de nível de biossegurança 2 (BSL-2).
- Administrar anestesia, 200-500 μL, por via intraperitoneal, dependendo do tamanho e peso do animal. Se estiver trabalhando sozinho, administre anestesia a um animal de cada vez para evitar matá-los antes da extração do órgão.
- Confirme a dose da anestesia beliscando o dedo do pé com uma pinça para avaliar o reflexo pedal. Não continue a menos que não responda completamente. Use pinos para prender o mouse a uma placa de cera. Neste ponto, mergulhe o camundongo em etanol 70% para evitar a contaminação do cabelo no procedimento de extração de órgãos.
- Sangramento terminal por punção cardíaca.
- Usando a tesoura e o fórceps, abra o animal através da cavidade torácica para expor o coração. Colete sangue por punção cardíaca (~ 800 μL), isso pode ser usado para vários ensaios, incluindo química clínica, hematologia, citometria de fluxo para detectar respostas específicas do antígeno e PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) para a análise do número de cópias virais.
- Para análise de RNA viral por qRT-PCR, colete sangue em um tubo EDTA se estiver extraindo de sangue total ou em um tubo de microcentrífuga se estiver extraindo do soro. (Para o soro, gire o tubo na velocidade máxima em uma centrífuga, temperatura ambiente, por 20 min e remova o soro para um tubo separado). Adicione uma poliacrilamida linear como transportador à amostra de soro após o acabamento. O RNA pode então ser analisado ou armazenado a -80 ° C para posterior processamento em uma data posterior.
- Encha a seringa de 20 ml com PBS, à temperatura ambiente (ou 37 °C), e perfunda os ratinhos inserindo a agulha borboleta no ventrículo esquerdo. Perfure o átrio direito para permitir a saída de sangue e PBS. Administre lentamente o PBS enquanto verifica a cor do fígado para confirmar que o animal está completamente perfundido. O fígado deve mudar de vermelho escuro para salmão rosa.
- Se estiver preparando os órgãos para histologia, deixe a agulha borboleta no lugar e depois perfunda com 20 mL de paraformaldeído a 4% gelado. Nesse caso, é conveniente conectar a seringa a uma torneira de 3 vias com ambas as seringas conectadas a ela, ligando e desligando a válvula à medida que se alterna entre PBS e PFA.
- Colha órgãos em tubos rotulados e pesados. Para órgãos periféricos, siga uma ordem estabelecida para a colheita: fígado, baço, rim e pulmões.
- Pegue apenas um lóbulo do fígado; não importa qual, mas para todos os experimentos sempre tente pegar o mesmo lóbulo com o mesmo pedaço de tamanho. Da mesma forma, para rins e pulmões, tome o mesmo rim e pulmão. Se a citometria de fluxo também for concluída, qualquer órgão pode ser cortado ao meio. Armazene a metade a ser usada para citometria em meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) em temperatura ambiente até que a colheita esteja completa.
- Imediatamente após a colheita, coloque cada órgão em um tubo rotulado e coloque-o no banho de gelo seco. O título do vírus diminui com o tempo à temperatura ambiente, portanto, o tempo necessário para a coleta de órgãos é extremamente importante. Deve haver consistência entre os mouses, portanto, após a segurança, a próxima prioridade é a velocidade.
nota: Se estiver colhendo órgãos para títulos virais, é muito útil ter um segundo indivíduo colhendo o cérebro neste momento, para preservar os títulos virais.
- Remova os órgãos restantes da cavidade do corpo do camundongo para obter acesso à coluna vertebral e ao crânio.
- Retire o mouse do tabuleiro e retire a pele, seguido da retirada dos braços e pernas.
Remova a cabeça do camundongo com uma tesoura de decapitação, cega ou cirúrgica para colher o cérebro, cortando o crânio com uma tesoura LaGrange serrilhada através do forame magno. Em seguida, retire o crânio com uma pinça e retire o cérebro com uma espátula.
- Usando uma tesoura forte e embotada, remova as costelas e outros ossos ao redor da coluna. Em seguida, corte o osso pélvico, expondo o forame vertebral no nível lombar. A pequena ponta da medula espinhal deve estar visível neste ponto.
- Use uma seringa de 10 mL cheia de PBS e uma agulha de 18 G para expelir a medula espinhal "lavando" a medula da coluna lombar para a coluna cervical sobre uma placa de Petri.
- Com cuidado, coloque a ponta chanfrada da agulha dentro do forame vertebral, evitando pressão excessiva para evitar que a agulha ultrapasse o corpo vertebral. Segure com força para exercer pressão sobre o corpo vertebral e a agulha e pressione o êmbolo da seringa para expelir o cordão. Transfira imediatamente a medula espinhal para o tubo rotulado e coloque-o no banho de gelo seco.
- Repita o procedimento com todos os animais até que a colheita seja concluída. Coloque as ferramentas de colheita no etanol 70% entre os animais. Concentre-se na consistência e velocidade. O período de tempo entre cada extração de órgão deve permanecer consistente para não enviesar os resultados do título viral.
- Quando terminar, desinfete o gabinete de biossegurança e todo o material antes de removê-lo do biotério.
- Remova cada tubo do banho de gelo e pese os tubos para determinar o peso do órgão. Para determinar o peso dos órgãos, subtraia o peso do tubo vazio do peso do tubo que contém o órgão.
NOTA: Neste ponto, os órgãos podem ser congelados a -80 ° C para processamento posterior em uma data posterior ou os órgãos podem ser homogeneizados imediatamente antes do congelamento de alíquotas individuais. O congelamento e descongelamento de amostras várias vezes diminui o título viral. Portanto, é importante fazer o mesmo procedimento para todos os experimentos dentro de um único projeto.
2. Homogeneização de órgãos
- Prepare 3 tubos rotulados de 1,5 mL com tampa de pressão para cada órgão a ser homogeneizado.
- Se as amostras não estiverem a ser homogeneizadas imediatamente após a colheita, retirar os tubos a -80 °C. As amostras não precisam ser descongeladas para homogeneizar.
- Coloque as amostras no gelo para mantê-las frias para minimizar a perda de título viral. Em seguida, adicione 1 mL de DMEM frio contendo 5% de FBS a cada tubo contendo órgão.
- Bata imediatamente os tubos em um batedor de contas de acordo com as instruções do fabricante. Homogeneizar todos os órgãos com esferas de aço em um instrumento homogeneizador de contas. Verifique se cada órgão foi completamente homogeneizado.
- Gire os detritos de órgãos em uma microcentrífuga a 12.000 x g por 5 min em uma microcentrífuga que foi resfriada a 8 ° C. Em seguida, retorne os tubos ao balde de gelo. Na cabine de biossegurança, alíquota de amostras em tubos para os ensaios necessários. Em seguida, retorne os tubos ao balde de gelo.
- Para ensaio de formação de foco, alíquota de 500 μL em um tubo marcado. Em seguida, coloque os tubos no rack em um balde de gelo. Alíquota de 50 μL em um tubo para RNA para RT-PCR quantitativo fluorogênico (qRT-PCR) para medir o número de cópias do genoma viral.
- Isole o RNA total dos órgãos dos animais infectados usando um kit comercial de isolamento de RNA. Determine o RNA viral do flavivírus usando os conjuntos de primer-sonda específicos para ZIKV, que reconhece sequências únicas em cada genoma de flavivírus. Determine o número de cópias virais usando um plasmídeo de controle de cópia contendo um RNA de fita simples positivo definido gerado in vitro usando a polimerase T7 contendo as sequências-alvo do ZIKV.
- Alíquota da amostra restante, que é de aproximadamente 300 μL, no terceiro tubo e armazene-a a -80 °C, se necessário.
NOTA: Se as amostras não foram congeladas anteriormente, congele a -80 °C. Se as amostras tiverem sido congeladas anteriormente, continue no ensaio de formação de foco e/ou isolamento de RNA antes de parar.
3. Ensaio de formação de foco do vírus Zika
NOTA: É importante incluir um controle sem vírus e um controle positivo. O controlo positivo é uma série de diluições de uma reserva de vírus com uma concentração conhecida. Nem todos os controles precisam estar na mesma placa, mas à medida que o ensaio se torna maior que 5 placas, mais controles devem ser adicionados e espalhados entre as placas. Tome cuidado para não arranhar a monocamada com as pontas da pipeta ou lavando vigorosamente. Vários órgãos podem ser titulados no mesmo dia ou em dias diferentes. No entanto, um órgão individual não deve ser titulado ao longo de vários dias, pois diferentes condições de ensaio podem afetar o título viral. É altamente recomendável executar um órgão individual em um único dia.
- Antes do dia do ensaio, prepare as células e os reagentes necessários para o ensaio de formação de foco.
- Prepare meios de crescimento contendo 500 mL de DMEM com 5 mL de HEPES e 25 mL de FBS. Ter células Vero-World Health Organization (OMS) crescendo em meios de crescimento a 37 °C, 5% de CO2 antes do início do ensaio. As células Vero não devem ser uma passagem alta ou ter crescido mais de 100% de confluência antes do início do ensaio.
- Prepare 500 mL de uma solução de metilcelulose a 2% autoclavando um frasco de mídia de vidro de 1 L com 10 g de metilcelulose e uma barra de agitação grande e um frasco de mídia de vidro separado de 1 L com 500 mL de H2O. Se a água autoclavada esfriar, reaqueça no micro-ondas até que a garrafa esteja quente ao toque, mas não fervendo.
- Despeje delicadamente água morna/quente em uma garrafa de metilcelulose enquanto estiver na capa de cultura de tecidos. Tampe parcialmente o frasco e mexa na placa de aquecimento até que a metilcelulose esteja em solução (1-4 h). Alicotar a solução de metilcelulose a 2% em um tubo cônico estéril de 50 mL. 2% de metilcelulose pode ser armazenado a 4 °C até que seja necessário.
- Prepare uma solução de paraformaldeído a 5% em PBS para fixar as placas e guarde-a a 4 °C até que seja necessário. Prepare um tampão de lavagem de ensaio formador de foco 1x adicionando 0,05% de Triton X-100 ao PBS e armazenado em RT. Prepare um tampão de coloração FFA 1x adicionando 1 mg / mL de saponina ao PBS e armazenado a 4 ° C até que seja necessário. Estes podem ser preparados com uma a duas semanas de antecedência.
- Calcule o número de placas de 96 poços de fundo plano necessárias para o ensaio, de modo que cada órgão seja revestido em triplicata. Incluir poços adicionais suficientes para controles positivos e negativos.
- Cultive células Vero suficientes em meios de crescimento para completar o ensaio projetado. Tripsinize as células Vero e conte-as, ressuspendendo-as a 1,5 x 10,5 células por mL em meio de crescimento. Células Vero em placas nas placas de fundo plano de 96 poços a 3,0 x 104 células Vero-WHO/poço em meio de crescimento, adicionando 200 μL por poço.
- Incube as placas a 37 ° C a 5% de CO2 durante a noite, certifique-se de que as placas estejam niveladas na incubadora para que as células sejam distribuídas igualmente dentro do poço.
NOTA: Cada laboratório cultiva células Vero de forma ligeiramente diferente; o alvo é uma monocamada confluente de 90-95% em cada poço no dia do ensaio para o vírus Zika.
- Dilua as amostras do vírus Zika no dia do ensaio. Se as amostras de órgãos tiverem sido previamente homogeneizadas, retirar as amostras do congelador a -80 °C e deixá-las descongelar antes de as colocar no gelo para o ensaio.
- No gelo, prepare uma placa de fundo redondo de 96 poços adicionando 180 μL de meio de crescimento frio às fileiras B a H, deixando a fileira A vazia. Adicionar 150 μL de cada amostra de órgão homogeneizado à linha A da placa inferior redonda.
- Preparar diluições seriais de 10 vezes de cada amostra, utilizando uma pipeta multicanal. Diluir as amostras numa placa de fundo redondo de 96 poços, adicionando 20 μL de amostra a 180 μL de meio de crescimento, trocando as pontas das pipetas entre cada diluição.
- Prepare a placa formadora de foco removendo a mídia da placa de fundo plano de 96 poços que cobre as células Vero. Faça isso imediatamente antes de adicionar as amostras de vírus para evitar que a monocamada seque.
- Adicione 100 μL da diluição do vírus a cada poço na placa Vero. Adicione uma amostra usando o mesmo conjunto de pontas, indo da concentração mais baixa para a mais alta. Balance as placas de um lado para o outro 2 a 4 vezes, tomando cuidado para não girar.
- Incube a 37 °C, 5% de CO2 por 1-2 h. Certifique-se de que as placas estejam niveladas dentro da incubadora. Durante a incubação, aqueça 2% de metilcelulose em RT.
- Diluir a solução de metilcelulose a 2% em meios de crescimento. A diluição deve ser feita numa proporção de aproximadamente 2:1 de 2% de metilcelulose para os meios de cultura. Mantenha-o em temperatura ambiente até a hora de usá-lo. Adicione 1-2 gotas/poço (defina a pipeta para 125 μL) do meio de metilcelulose: crescimento a cada poço da placa de 96 poços.
- Incubar 32-40 h a 37 °C, 5% CO2. Como as células Vero de cada pessoa crescem de maneira ligeiramente diferente, fatores como a confluência celular e a cepa do vírus Zika podem alterar o tempo de incubação.
- Fixe as células Vero usando a solução preparada de paraformaldeído a 5%.
- Adicione 50 μL de paraformaldeído a 5% a cada poço por cima da camada de metilcelulose no gabinete de biossegurança. Incubar por 60 min em RT. A fixação pode ser feita durante a noite a 4 °C, mas cubra a placa com parafilme para reduzir a evaporação.
- Despeje a sobreposição e a mídia das células em um recipiente de descarte dentro do gabinete de biossegurança. Lave suavemente com PBS, 150 μL / poço. Remova o PBS das placas e remova a placa do BSL-2.
- Repita a lavagem com PBS 2x adicionando 150 μL / poço. Em seguida, remova o PBS. Adicione 150 μL/poço 1x tampão de lavagem FFA e deixe descansar por 5-10 min em RT para permeabilizar as células fixas.
- Detecte a infecção usando o anticorpo primário contra o zika. Prepare o anticorpo primário 4G2 (D1-4G2-4-15) a uma concentração de 1 μg/mL em tampão de coloração FFA. Prepare anticorpos suficientes para todo o ensaio.
nota: Fique longe de fraldas de laboratório ou outro material absorvente com alto teor de fiapos, pois as fibras afetarão negativamente a imagem dos focos.
- Remova o tampão de lavagem FFA das placas. Adicione 50 μL/poço do anticorpo primário no tampão de coloração FFA. Selar as placas com parafilme e incubar durante a noite a 4 °C sobre uma plataforma de balanço. O ensaio pode ser feito com uma incubação por 2 h em RT.
- Visualize a infecção com a adição de um anticorpo secundário conjugado com HRP. Prepare o anticorpo secundário anti-camundongo marcado com HRP de cabra a uma concentração de 1:5.000 no tampão de coloração FFA. Prepare anticorpos suficientes para todo o ensaio.
- Lave as células 3x com tampão de lavagem FFA, removendo o tampão de lavagem jogando-o na pia a cada vez. Manchar as células com o anticorpo secundário em tampão de coloração FFA a 50 μL / poço. Incubar 1-2 h em RT.
- Lave as células 3x com tampão de lavagem FFA, removendo o tampão de lavagem jogando-o na pia a cada vez. Adicione 50 μL/poço do substrato Trueblue.
- Observe as placas com atenção, esperando de 2 a 15 minutos até que as manchas estejam totalmente definidas e o fundo mínimo. Depois que as manchas estiverem visíveis, lave suavemente com água, usando a mão para proteger a monocamada da força da água que corre. Seque em toalhas de papel (NÃO FRALDAS) e crie imagens o mais rápido possível.
- Os pontos podem ser contados manualmente ou usando um contador de pontos automatizado. Se contado manualmente, um escopo de dissecação pode ser usado para ajudar na visualização.
- Para cada amostra, selecione uma diluição com focos facilmente distinguíveis (por exemplo, 20 a 200 por alvéolo) e calcule o título em unidades formadoras de foco por mL (FFU/ml), usando a média dos poços duplicados: FFU/mL = (focos médios/poço) × (fator de diluição) ÷ (mL de inóculo).
