Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Coleta de sangue e isolamento de plaquetas
- Colete sangue humano de doadores adultos saudáveis consentidos por punção venosa no dia do experimento em citrato trissódico a 3,8%. Um tubo de sangue de 4,5 mL é suficiente para produzir plasma rico em plaquetas (PRP) suficiente para 20-25 condições em doadores cujas contagens de plaquetas estão próximas de 250 x 10,3 por μL.
nota: Evite tirar sangue através de agulhas de calibre estreito (menores que 21 G).
- Preparar o PRP por centrifugação a 22 °C e 140 x g durante 12 min com um travão longo. Isso resultará em duas camadas distintas, com glóbulos vermelhos na parte inferior e o PRP de cor clara na parte superior.
- Isole a camada superior, turva e amarela do PRP por meio de pipetagem cuidadosa através de uma ponta de pipeta cortada em um ângulo de 45 ° e obtenha a contagem de plaquetas por meio de um hemograma completo (CBC).
- Se necessário, lave as plaquetas em solução salina tamponada com ácido 1,4-piperazina dietanossulfônico (PIPES) (cloreto de sódio 150 mM, NaCl, PIPES 20 mM) na presença de prostaglandina E1 (PGE1) e ressuspenda no tampão de Tyrode (NaCl 134 mM, hidrogenofosfato dissódico 0,34 mM, Na2HPO4, cloreto de potássio 2,9 mM, KCl, cloreto de magnésio 1 mM, MgCl2, 5 mM de glicose, 12 mM de bicarbonato de sódio, NaHCO3, 20 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico, HEPES, pH 7,35) com 5 mM de glicose, caso contrário, prossiga para a etapa 1.5. As etapas a seguir descrevem a lavagem em breve.
- Ajuste o volume de PRP para 10 mL com solução salina tamponada com PIPES e adicione 0,6 μM de PGE1.
- Centrifugue por 8 min a 1.900 x g, depois descarte o sobrenadante e deixe o sedimento de plaquetas descansar em 400 μL de solução de Tyrode e glicose por 5 min.
- Ressuspenda suavemente o pellet de plaquetas e mantenha-o intacto por 30 min.
- Ajuste a contagem de plaquetas para ~ 250 x 103 plaquetas por μL com plasma pobre em plaquetas humanas (PPP) e mantenha a suspensão a 22 ° C sem perturbações ou sob rotação suave.
2. Anticorpo e tratamento uniforme de cisalhamento
NOTA: Todas as etapas da seção 2 que requerem pipetagem devem ser feitas lentamente, para não introduzir nenhum cisalhamento.
- Adicione o anticorpo desejado ao PRP ou plaquetas lavadas e misture delicadamente pipetando para cima e para baixo ou mexendo com uma ponta de pipeta. Deixe-o intacto em temperatura ambiente por 5-10 min. Adicione um volume equivalente de PPP ou buffer de Tyrode a um controle negativo.
- Ligue o viscosímetro de placa cônica, ajuste a temperatura da placa para 22 °C e dê tempo para que a placa atinja essa temperatura.
- Pipete o PRP tratado ou as plaquetas lavadas no viscosímetro da placa cônica com temperatura controlada diretamente no centro da placa. Certifique-se de que toda a amostra seja depositada entre o cone e a placa no ponto de contato, e não na parte externa da borda do cone.
- Cisalhamento a uma taxa e duração adequadas.
- Calcule o cisalhamento conforme indicado pelo manual do viscosímetro ou conforme mostrado anteriormente.
- Determinar a taxa de cisalhamento da viscosidade e a tensão de cisalhamento desejada por meio da lei da viscosidade de Newton;
; a viscosidade plasmática é de 1,5-1,6 centipoise (cP). Por exemplo, uma faixa de cisalhamento normal para circulação humana é de 5 a 30 din/cm2, e o cisalhamento deve ser aplicado na escala de tempo de um dígito minuto.
- Levante o cone ligeiramente (~ 2 mm) para que a amostra permaneça em contato com a placa e o cone e use uma ponta de pipeta longa ou outra ponta de pipeta longa para coletar 5-10 μL do centro do volume da amostra.
- Incube as amostras cortadas com os marcadores desejados por 20 min em temperatura ambiente. Para marcadores de exposição à fosfatidilserina, β-galactose e P-selectina, use o domínio Lactadherin C2 (LactC2) a 0,08 μM, lectina Erythrina cristagalli (ECL) a 6,25 μg/mL e anticorpo anti-P-selectina (20 μg/mL), respectivamente.
- Fixar as amostras em paraformaldeído a 2% durante 20 min à RT antes da diluição ou armazenamento refrigerado e prosseguir para o passo 3.1 ou armazenar amostras a 4 °C durante um período não superior a 12 h.
3. Detecção de marcadores de superfície e reticulação por citometria de fluxo
- Analise a amostra por citometria de fluxo, coletando pelo menos 20.000 eventos para cada condição.
- Quantifique a intensidade do sinal dos marcadores fluorescentes usando o valor da altura para a intensidade de cada fluoróforo ou a intensidade média geométrica de fluorescência (MFI).
- Se o objetivo é detectar a reticulação plaquetária após o tratamento de cisalhamento, analise a amostra em um citômetro de fluxo com capacidade de imagem e quantifique a reticulação por parâmetros de área e proporção.
- Plote um histograma de área e/ou proporção.
- Use um controle negativo com albumina de soro bovino (BSA) ou veículo para desenhar uma porta excluindo a maioria dos eventos totalmente circulares (essa porta geralmente é desenhada em uma proporção ~ 0,8) e quantificar a porcentagem de eventos dentro dessa porta. Eventos com uma proporção mais baixa têm maior probabilidade de serem reticulados.
