Avaliação do potencial antimicrobiano de isolados bacterianos fecais murinos produtores de bacteriocina

Resumo

Fonte: Bäuerl, C., et al. Um método para avaliar os efeitos da bacteriocina na microbiota intestinal de camundongos. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra a detecção de bactérias lácticas produtoras de bacteriocina derivadas de matéria fecal de camundongos. O ensaio determina a atividade antimicrobiana da bacteriocina em cepas bacterianas específicas.

Protocolo

1. Contagem de LAB e atividade de bacteriocina

1. Pese um pellet fecal de cada amostra em um tubo de 1,5 mL e adicione um volume adequado de NaCl a 0,9% gelado para obter uma solução de 10% (p / v). Use micropilões estéreis para tubos de 1,5 mL para homogeneizar a suspensão fecal e preparar diluições seriais de dez vezes em NaCl a 0,9% gelado.
2. Conte o número total de células LAB.
   1. Transfira células diluídas (100 μL) para 4 mL de ágar mole Man Rogosa Sharpe (MRS) pré-aquecido (50 ° C, ágar 0,8%). Misture por vórtice antes de despejar as células em uma placa sólida de ágar MRS (ágar 1,5%).
   2. Seque a placa retirando a tampa por 5 a 10 minutos na coifa estéril antes de incubar as células por 20 a 24 h a 30 °C para crescimento celular e formação de colônias.
3. Conte as células produtoras de bacteriocina.
   1. Transfira as células diluídas (100 μL) do produtor de bacteriocina para 4 mL de ágar mole MRS pré-aquecido (50 ° C, ágar 0,8%), misture por vórtice e despeje as células em uma placa de ágar MRS (ágar 1,5%); esta camada é chamada de primeira camada.
   2. Transfira mais 4 mL de ágar mole MRS livre de células (ágar 0,8%) para a primeira camada para incorporar todas as células dentro do ágar mole.
      nota: Essa camada destina-se a impedir que as células cresçam como colônias na superfície das placas de ágar. As células que crescem na superfície são facilmente deslocadas ao despejar células indicadoras no topo (etapa 4.3.4) e, portanto, complicam a interpretação dos resultados. Essa camada é chamada de segunda camada.
   3. Seque a placa retirando a tampa por 5 a 10 minutos na coifa estéril antes de incubar por 20 a 24 h a 30 °C para crescimento celular e formação de colônias.
   4. Para identificar colônias produtoras de bacteriocina, misture 40 μL de uma cultura noturna de uma cepa indicadora apropriada, com 4 mL de ágar mole pré-aquecido. Despeje a mistura no prato; Essa camada é chamada de terceira camada.
   5. Seque a placa retirando a tampa por 5 a 10 min na coifa estéril antes de incubar por 20 a 24 h a 30 °C para crescimento celular e formação de colônias.
      nota: As colônias produtoras de bacteriocina têm zonas claras (inibição) ao redor das colônias (Figura 1).

Resultados

Figura 1: Detecção da produção de bacteriocina em LAB recuperada de fezes por um protocolo de três camadas (conforme descrito no procedimento)

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de Petri de plástico	Thermo Científico	101VR20
Caldo de infusão cérebro-coração	Conda	1400
Ágar bacteriológico europeu	Pronadisa	1800
Agarose D1 baixo EEO	Pronadisa	8010
1x tampão TAE	Thermo Científico	15558042
Caldo MRS	Difco	Rolamento 288130
Comprimidos PBS	sigma	P4417-100TAB
escala	Mettler Toledo	PB602-S