1. Plaqueamento de BMMs em lamínulas para infecção
- Prepare placas de cultura de tecidos de 6 poços colocando quatro (4) lamínulas de vidro estéreis de 12 mm (autoclavadas e armazenadas em um recipiente de vidro fechado) no fundo de cada poço vazio.
nota: Pegue cada lamínula estéril de 12 mm com uma ponta de aspiração encaixada em uma linha de vácuo. Coloque as lamínulas nos poços sem sobreposição, soltando-as na posição desejada apertando o tubo para interromper o vácuo.
- Aspire o meio (e quaisquer células não aderentes) de placas de Petri revestidas com macrófagos derivados da medula óssea aderentes e enxágue suavemente as células aderentes 2x com solução salina estéril tamponada com fosfato de Dulbecco sem cloreto de cálcio e magnésio (PBS -/-) pré-aquecido a 37 ° C.
- Adicione gota a gota, 5 mL estéril 1x PBS -/- com uma concentração final de 1 mM EDTA a cada placa de Petri e incube por 5 min a 37 ° C para separar os BMMs aderentes. Verifique se as células estão destacadas usando um microscópio.
- Colete todas as células destacadas suspensas em 1x PBS -/- suplementado com 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em um tubo cônico de 50 mL. Enxágue cada prato 2x com 5 mL de PBS -/- e adicione à piscina de suspensão celular.
nota: A suspensão celular pode ser diluída com PBS adicional -/- para proteger os macrófagos da toxicidade do EDTA durante o processo de colheita.
- Centrifugue a 300 x g por 10 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os macrófagos em meio BMM de 5 a 10 mL por pipetagem. Coloque as células ressuspensas no gelo para evitar a fixação em tubos e aglomeração.
- Contagem de células viáveis usando exclusão de azul de tripano no hemocitômetro.
nota: Para contar as células BMM ressuspensas em meio de 5 mL, uma mistura de diluição de 25 μL de suspensão de células em 445 μL de PBS -/- e 30 μL de solução de azul de tripano a 0,4% normalmente permite uma fácil quantificação em um hemocitômetro (levando em consideração um fator de diluição de 20x para o cálculo final). Conte apenas as células que não foram coradas com azul de tripano (células viáveis). O volume da suspensão celular pode ser alterado se esta mistura estiver demasiado concentrada ou diluída. Em geral, o rendimento de BMM por preparação varia entre 2 x 107 e 5 x 107 células de um único camundongo.
- Prepare a suspensão celular em meio BMM na concentração de plaqueamento desejada (5 x 105/mL) e disperse a suspensão em placas de 6 poços em meio de 2 mL por poço para que cada poço receba 1 x 106 macrófagos.
nota: Esta é uma etapa crítica que garante que cada poço receba o número adequado de macrófagos para cobrir as lamínulas uniformemente. Verifique se as lamínulas nos poços não estão sobrepostas ou flutuando no meio. Nesse caso, ajuste suavemente com uma ponta de pipeta estéril.
- Incubar durante a noite a 37 °C, 5% CO2.
2. Purificação de Formas Infecciosas de L. amazonensis
NOTA: Prepare Leishmania para infecções - purifique promastigotas metacíclicos de culturas promastigotas estacionárias ou diferencie promastigotas em cultura na forma amastigota usando o protocolo padrão de diferenciação axênica de L. amazonensis.
- Purificação de promastigotas metacíclicos de Leishmania utilizando meios de gradiente de densidade (Materiais)
- Prepare a solução estoque a 40% de meio de gradiente de densidade em água estéril e livre de endotoxinas.
- Diluir a solução de gradiente de densidade em meio M199 10x (sem soro) para preparar a concentração de 10% no meio M199.
- Filtre todas as soluções através de um filtro de 0,22 μm.
nota: As soluções de estoque podem ser armazenadas a 4 °C na escuridão por não mais de 1 mês.
- Adicione 2 mL de solução de mídia de gradiente de densidade a 40% no fundo de um tubo de centrífuga cônico de 15 mL.
- Camada 2 mL de solução de mídia gradiente de densidade de 10% em M199 sobre a camada de mídia gradiente de densidade de 40% com cuidado, usando uma pipeta Pasteur para evitar qualquer mistura entre as duas camadas.
- Colete 1 x 109 parasitas da cultura em fase estacionária por centrifugação a 1.900 x g por 10 min.
- Ressuspenda as células em 6 mL de meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM).
- Camada 2 mL da suspensão celular diretamente sobre a camada de mídia de gradiente de densidade de 10%, suavemente, usando uma pipeta Pasteur para evitar a mistura entre as camadas.
- Centrifugue o gradiente por 10 min a 1.300 x g em temperatura ambiente.
nota: Devido às diferenças nas propriedades físicas entre as espécies de Leishmania, as condições de centrifugação para cada uma podem ter que ser ligeiramente ajustadas para garantir o rendimento máximo.
- Coletar parasitas (enriquecidos na forma promastigota metacíclica) da banda formada no limite superior do meio de gradiente de densidade de 10% (interface entre as camadas de meio de gradiente de densidade de 0% e 10%).
- Diluir os parasitas com um volume de DMEM e coletá-los por centrifugação (1.900 x g durante 10 min à temperatura ambiente).
- Ressuspender em meio DMEM de 500 μL e contar em um hemocitômetro para quantificar o rendimento.
- Geração de amastigotas de L. amazonensis em condições de cultivo axênico (baixo pH / temperatura elevada).
- Misture 5 mL de cultura promastigota em fase logarítmica (pH 7,4 a 26 oC) com um volume igual de meio amastigota (pH 4,5), usando frascos de 25 cm2 (total de 10 mL de meio) e incube a 26 ° C durante a noite.
- Deslocar o balão de 26 °C para 32 °C.
- Após 3 ou 4 dias, dividir a cultura 1:5 em meio amastigota a 32 °C.
- Verifique os parasitas nos próximos 3 a 4 dias (máximo de 7 dias) para ver se eles estão prontos para uso em infecções.
nota: As amastigotas axênicas saudáveis devem ter formato oval, sem flagelos visíveis. As amastigotas parcialmente diferenciadas têm uma grande forma oval com flagelos curtos. A cultura não deve ter muitos aglomerados - muitos aglomerados são uma indicação de parasitas que não crescem e estão morrendo. A cultura amastigota pode ser dividida 1:5 e mantida por no máximo 3 semanas.
3. Infecção por L. amazonensis
- Dilua as suspensões de parasitas de acordo com o MOI desejado (geralmente 3-5 promastigotas metacíclicos por macrófago [MOI de 1:3 ou 1:5] e 1 amastigota por macrófago [MOI 1:1]). Adicione Leishmania em PBS -/- em um volume de 50 - 100 μL a cada poço que já contém 2 mL de meio.
- Incubar BMMs por 1 h com amastigotas e 3 h com promastigotas metacíclicos a 34 oC para infecção.
nota: A temperatura ideal de infecção pode variar de acordo com a espécie.
- Após a incubação, lave completamente os parasitas livres em cada poço 3x com 2 mL de PBS -/- pré-aquecido a 37 °C.
nota: Disperse o PBS suavemente para garantir que as lamínulas não flutuem umas sobre as outras. Gire suavemente a placa e aspire o líquido. Use pontas de aspiração separadas se estiver usando várias cepas de parasitas para evitar contaminação cruzada.
- Fixe amostras de ponto de tempo de 1 h ou 3 h incubando cada poço com 1,5 - 2 mL de PFA a 2% em PBS -/- por 10 min. Lave 3x com PBS -/-. Não aspire as placas de última lavagem e refrigere as placas contendo lamínulas em PBS até a coloração.
- Adicionar 2 ml de meio BMM fresco a cada alvéolo em placas para obter mais pontos de tempo e incubar a 34 °C.
- Fixe os pontos de tempo restantes conforme desejado, conforme descrito na etapa 4.3, e refrigere as placas até a coloração.
4. Coloração DAPI e montagem em lamínula
- Aspire PBS de poços contendo lamínulas e adicione 1,5 mL de PBS -/- com 0,1% de detergente não iônico. Incubar por 10 min em temperatura ambiente, seguido de 3x lavagem com 2 mL de PBS -/-.
- Adicionar 1 mL de PBS -/- com 2 μg/mL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (diluído a partir de 5 mg/mL de solução-mãe em água) aos poços contendo lamínulas e incubar por mais 1 h em temperatura ambiente.
nota: O tempo de incubação com DAPI é fundamental para a visualização adequada de parasitas de Leishmania intracelulares. Os núcleos dos macrófagos se coram rapidamente, devido ao seu maior tamanho e conteúdo de DNA, mas a coloração dos núcleos dos parasitas intracelulares é mais lenta. Assim, estender o tempo de incubação além do necessário para visualizar os núcleos do BMM é necessário para permitir que o DAPI permeie a membrana plasmática do parasita e a membrana nuclear do parasita. Com a coloração DAPI adequada, o DNA do cinetoplasto mitocondrial próximo à bolsa flagelar do parasita também pode ser visualizado, além do DNA nuclear.
- Lave cada poço contendo lamínulas 3x com 2 mL de PBS -/- e, em seguida, levante e vire as lamínulas com uma pinça para colocar o lado da célula para baixo e monte em lâminas de microscópio de vidro com um reagente de montagem antidesbotamento disponível comercialmente.
nota: As lamínulas são extremamente frágeis e precisam de manuseio cauteloso. Evite pressioná-los, especialmente contra a parede lateral dos poços ao levantar. A adição de algumas gotas de PBS -/- reduz a tensão superficial entre a lamínula e o poço e facilita o processo de elevação. Uma agulha de calibre fino pode ser usada para ajudar a erguer as lamínulas do fundo do poço. Depois de colocar uma lamínula na lâmina, pressione suavemente com uma pinça para empurrar para fora quaisquer bolhas de ar na mídia de montagem. Se uma lamínula estiver quebrada ou possivelmente tiver virado durante o processo de elevação, não remonte; basta usar a quarta lamínula sobressalente.
- Refrigerar as lâminas até à quantificação.
5. Quantificação de infecção
- Examine as lâminas coradas com DAPI sob um microscópio de fluorescência, concentrando-se nos macrófagos usando uma lente objetiva de 100X com óleo de imersão (excitação a 358 nm; emissão ideal a 461 nm).
Certifique-se de que o foco esteja na camada de macrófagos entre a lâmina de vidro e a lamínula.
- Quantifique o número de macrófagos (núcleos grandes corados com DAPI) e o número de núcleos amastigotas menores agrupados em torno de cada núcleo de macrófago (ver Figura 1A, DAPI) para cada campo de visão, usando um contador manual.
nota: Os núcleos amastigotas podem não ser todos visíveis em um plano de foco devido ao seu pequeno tamanho. Conte aqueles que são visíveis quando focados nos núcleos dos macrófagos e, em seguida, use o foco fino para verificar se há núcleos do parasita nos planos acima e abaixo dos núcleos dos macrófagos.
- Vá para outro campo de visão para repetir a quantificação. Use uma chave de contador separada para rastrear o número de campos contados. Percorra os campos visuais em linhas paralelas em cada lamínula, para evitar a sobreposição de contagem.
- Quantificar um mínimo de 200 macrófagos por lamínula. Quantificar cada ponto temporal da infeção em triplicata (3 lamínulas). Conte a quarta lamínula se uma das anteriores não for adequada para contagem devido à sobreposição da lamínula, má montagem, quebra de vidro, etc.
nota: Se 200 macrófagos não puderem ser contados em nenhuma lamínula, conte o quarto sobressalente.
- Calcule as taxas de infecção como amastigotas/macrófagos ou amastigotas/100 macrófagos e determine a porcentagem de macrófagos infectados a partir dos dados brutos de quantificação.
