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1. Preparação de bactérias
NOTA: Substratos bacterianos de células inteiras e peptidoglicanos purificados são usados como substratos enzimáticos tanto no ensaio de difusão em microlâminas quanto no ensaio de liberação de corante. Esses substratos requerem preparação antes de conduzir as reações enzimáticas. O protocolo a seguir descreve sua preparação.
- Substrato de célula bacteriana inteira
- Produzir substrato celular bacteriano inoculando 500 ml de caldo nutritivo com uma cultura noturna de 2 ml de Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection; ATCC 23857). Incubar a 30 °C com agitação (125 rpm) até que a cultura atinja uma fase exponencial de crescimento, definida como uma fase de crescimento rápido que resulta na duplicação da cultura bacteriana. Para o cultivo de Salmonella enterica subsp. enterica (ATCC 10708), use caldo nutriente como meio de crescimento a 37 °C com agitação (125 rpm).
- Mate cada cultura por autoclavagem por 10 min a 121 °C sob 3 atm de pressão.
- Colha o substrato bacteriano morto pelo calor por centrifugação por 20 min a 5.000 x g. Lave o pellet três vezes com água Tipo 1 e ressuspenda em uma quantidade mínima de água. Neste estudo, suspenda os substratos em 1.200 μl.
- Alíquota de 300 μl dos substratos das células bacterianas para tubos de microcentrífugas de 1,5 ml e conservar a 20 °C.
2. Rotulagem de substrato - Rotulagem de corante Remazol Brilliant Blue R
NOTA: No ensaio de liberação de corante, o substrato é covalentemente ligado ao corante Remazol azul brilhante R. O protocolo a seguir descreve a preparação de substratos enzimáticos tingidos.
- Fazer uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) a 250 mM dissolvendo 1 g de NaOH em 99 ml de água Tipo I a ser utilizada para fazer uma solução de corante azul brilhante R (RBB) de Remazol a 200 mM.
- Fazer uma solução de RBB a 200 mM dissolvendo 1,25 g de RBB em 98,75 ml ± 1 ml de uma solução fresca de NaOH a 250 mM.
- Ressuspenda as células bacterianas mortas pelo calor a uma concentração de 0,5 g de peso húmido em 30 ml de solução de RBB. Para o peptidoglicano purificado, ressuspenda o peptidoglicano a uma concentração de 0,3 g de peso húmido em 30 ml de solução de RBB.
- Incubar a mistura de reacção num erlenmeyer sobre uma plataforma rotativa durante 6 horas a 37 °C, misturando suavemente.
- Transfira a mistura de reação para uma incubadora a 4 °C e incube por mais 12 horas com uma mistura suave.
- Após a incubação, colha o substrato tingido por centrifugação a 3.000 x g por 30 min. Transvase a solução de corante do pellet de substrato.
- Remova o corante solúvel não covalentemente ligado dos substratos lavando as células marcadas com corante ou peptidoglicano repetidamente (aproximadamente 3-5 lavagens) com água Tipo I seguida de centrifugação. A cada adição de água, ressuspenda completamente o pellet.
nota: Quando não ligado, o corante solúvel não é mais visível na lavagem com água após a centrifugação. O substrato deve receber uma lavagem adicional. Observe que o substrato permanecerá azul, enquanto o sobrenadante da última lavagem será claro.
- Armazene os substratos tingidos suspensos em uma quantidade mínima de água a -20 °C para uso posterior.
3. Ensaio quantitativo de liberação de corante
NOTA: Durante o ensaio de liberação de corante, a hidrólise do substrato tingido com RBB na reação enzimática libera produtos tingidos no sobrenadante da reação. A medição colorimétrica da quantidade de corante liberado indica a quantidade de atividade enzimática presente na amostra para uma determinada enzima. O método quantitativo permite a comparação de diferentes enzimas entre substratos e permite a variação das condições ambientais que influenciam a reação enzimática (por exemplo, temperatura, salinidade e pH). O protocolo a seguir descreve a preparação e o desempenho do ensaio de liberação de corante para detectar quantitativamente a atividade enzimática de antimicrobianos proteicos.
- Preparação para o ensaio de liberação de corante
- Deixar o substrato tingido congelado regressar à temperatura ambiente e lavar duas vezes com tampão de ensaio (solução salina tamponada com fosfato, PBS), que é determinado empiricamente para a enzima em causa.
- Calcule o volume de suspensão de substrato necessário multiplicando o volume de reação de 200 μl pelo número de ensaios de liberação de corante a serem realizados.
- Preparar a suspensão do substrato adicionando o substrato tingido ao volume do tampão de ensaio, determinado em 4.1.2, até se atingir uma densidade óptica (DO) de 2,0 a 595 nm, utilizando um espectrofotómetro. Para permanecer dentro das limitações funcionais do espectrofotômetro, medir o 2.0 OD595 como 1.0 para uma diluição de 1:1 da solução concentrada. Use o tampão de ensaio como um blank.
nota: A turbidez do substrato para a reação pode ser aumentada além de 2,0 para corresponder aos níveis de atividade de enzimas altamente eficientes.
- Suspender a proteína antimicrobiana a avaliar em tampão de ensaio a uma concentração estimada de 1 mg/ml.
- Usando o ensaio de microplaca de um kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico (BCA) de acordo com o protocolo do fabricante, determine a concentração real da proteína sample a ser analisado. Ajustar a concentração da suspensão de reserva para 1 mg/ml utilizando tampão de ensaio.
- Usando o ensaio de liberação de corante para determinar as condições ideais de incubação para um antimicrobiano proteico
- Diluir a suspensão antimicrobiana de proteínas de reserva para 100 ng/μl. Esta concentração dá uma massa de reação final de 1 μg de proteína por volume (10 μl) adicionado à reação do ensaio.
- Determinar a gama térmica a avaliar para a proteína bacteriolítica. A faixa térmica nesses ensaios incluiu 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C e 65 ° C.
- Realizar os ensaios de reacção em tubos de microcentrífugas de 0,5 ml. Para cada condição térmica, adicione 10 μl da proteína estoque a 200 μl de suspensão de substrato preparada.
- Incubar em um termociclador por 8 horas com mistura por inversão uma vez por hora.
- Após a incubação, interrompa as reações adicionando 25 μl de etanol.
- Remova o substrato insolúvel não digerido por centrifugação a 3.000 x g por 2 min e transfira 150 μl do sobrenadante de reação para cada mistura de reação para uma microplaca de fundo plano de 96 poços, tomando cuidado para não romper o pellet de substrato não digerido.
- Meça a atividade enzimática da proteína antimicrobiana para o substrato dado, determinando a quantidade de corante RBB solúvel dissociado do substrato após hidrólise enzimática. Para quantificar a actividade enzimática, medir a absorvância do sobrenadante a 595 nm utilizando um espectrofotómetro de microplacas. O aumento da absorbância pelo corante solúvel liberado no sobrenadante a partir do substrato marcado é uma medida quantitativa da atividade enzimática.
nota: A mudança na absorbância é representada por unidades de atividade (UA), onde 1 UA resulta em um aumento de 0,01 na densidade óptica do sobrenadante da reação de liberação de corante a 595 nm. Uma reação em branco, incubada com todos os componentes da reação, exceto a enzima, é usada para subtrair qualquer corante que seja liberado do substrato marcado com RBB devido à incubação. A temperatura enzimática ideal fornece a medição da unidade de atividade de pico.