Um ensaio de placa pontual para avaliar as respostas ao estresse oxidativo em cepas bacterianas

Resumo

Fonte: Ketelboeter, L. M. et al., Métodos para inibir a produção bacteriana de piomelanina e determinar o aumento correspondente na sensibilidade ao estresse oxidativo. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra um ensaio de placa pontual adaptado para avaliar as respostas ao estresse oxidativo de cepas bacterianas. Algumas cepas produzem piomelanina, um pigmento antioxidante. Por outro lado, as cepas tratadas com um agente de teste, levando à redução da produção de piomelanina, exibem maior suscetibilidade ao estresse oxidativo, resultando em diminuição da viabilidade celular em comparação com as cepas produtoras de piomelanina.

Protocolo

1. Preparação de meios de cultura, antibióticos e 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanodiona (NTBC)

1. Faça o caldo Luria-Bertani (LB) (1% de triptona, 0,5% de extrato de levedura, 0,25% de cloreto de sódio, NaCl em H₂O) e alíquota em volumes apropriados. Esterilizar em autoclave. Armazene em temperatura ambiente.
2. Fazer 100 ml de ágar LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, 0,25% de NaCl, 1,5% de ágar em H₂O) em balões de 250 ml. Esterilize em autoclave e armazene em temperatura ambiente. Certifique-se de que o ágar esteja derretido antes de despejar em pratos.
   nota: Os frascos contendo 100 ml de ágar-LB produzirão 4 placas. A quantidade de ágar LB pode ser alterada para corresponder ao número de placas necessárias para o ensaio.
3. Faça solução salina tamponada com fosfato, PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM de cloreto de potássio, KCl, 10 mM de hidrogenofosfato dissódico, Na₂HPO₄, 2 mM de di-hidrogenofosfato de potássio, KH₂PO₄). Esterilize por autoclave ou filtração e armazene em temperatura ambiente.
4. Prepare as soluções de estoque de antibióticos para gentamicina, canamicina e tobramicina.
   1. Preparar concentrações de estoque de antibióticos apropriadas para cepas de Pseudomonas aeruginosa contendo 100 mg/ml de gentamicina, 30 mg/ml de canamicina e 10 mg/ml de tobramicina. Dissolver os antibióticos em água, filtrar esterilizar (0,2 μm) e conservar a 4 °C. Alterar os antibióticos e as concentrações em função da bactéria estudada.

2. Ensaio de placa pontual para resposta ao estresse oxidativo

1. Estabelecer culturas durante a noite das estirpes a testar. Adicione 2 ml de caldo LB a 16 tubos de ensaio de 150 mm (um por cepa) e inocule com 1 colônia isolada de cada cepa. Incubar durante a noite a 37 °C com arejamento num rotador de cultura de tecidos numa incubadora de ar.
2. Meça o OD₆₀₀ das culturas noturnas. Lave as culturas antes de fazer leituras de OD₆₀₀ para eliminar a piomelanina presente no meio.
3. Lave as culturas centrifugando 1 ml de cultura em uma microcentrífuga a 16.000 x g por 2 min. Remova o sobrenadante e quaisquer células frouxamente peletizadas com um micropipetador e ressuspenda o pellet de células sólidas em 1 ml LB.
4. No dia seguinte, prepare placas de ágar LB contendo H₂O₂ como um estressor oxidativo. Uma faixa de concentrações de H₂O₂ de 0 a 1 mM é um bom ponto de partida.
   1. Derreta os balões de ágar-ágar LB. Resfrie o meio a aproximadamente 50 °C em temperatura ambiente.
   2. Adicionar H₂O₂ directamente ao meio arrefecido nas concentrações desejadas. Frascos de redemoinho para misturar. Ver quadro 1 para as concentrações de H₂O₂ e os volumes de H₂O₂ concentrados a adicionar. Estes valores baseiam-se em 100 ml de ágar LB.
   3. Despeje as placas imediatamente após adicionar H₂O₂ e chame a superfície para remover as bolhas. O rendimento é de 4 placas por 100 ml de ágar LB. Marque as placas com a concentração H₂O₂.
   4. Coloque as placas descobertas em uma coifa de fluxo biológico com o ventilador funcionando por 30 min para remover o excesso de umidade das placas.
      nota: Use os pratos no mesmo dia em que são preparados. Não fazer isso pode resultar em dados inconsistentes.
      nota: Estressores oxidativos, como o paraquat, podem ser substituídos por H₂O₂ neste ensaio. As concentrações usadas para outros estressores oxidativos podem ser diferentes daquelas usadas para H₂O₂.
5. Lave e meça o OD₆₀₀ das culturas noturnas.
6. Normalize o OD₆₀₀ de todas as culturas noturnas para o valor mais baixo para o conjunto de cepas que estão sendo testadas. P. aeruginosa geralmente tem um OD₆₀₀ de aproximadamente 2,5 quando cultivado durante a noite em LB.
   1. Determinar o volume de cultura necessário para diluir a cultura até ao mínimo de₆₀₀ OD num volume total de 1 ml. Por exemplo, se uma cultura tiver uma DO₆₀₀ de 3 e a DO₆₀₀ mais baixa para o conjunto de estirpes for 2,5, efectue o seguinte cálculo: (2,5)(1 ml) = (3)(x). x = 0,833 ml. 0,833 ml de cultura serão colocados em um tubo de microcentrífuga.
   2. Calcular a quantidade de LB + DMSO necessária para elevar o volume de cultura a 1 ml. Para o exemplo na etapa 4.4.1, a quantidade de LB + DMSO adicionada à cultura seria de 0,167 ml (volume total de 1 ml – 0,833 ml de cultura). Faça soluções de estoque de LB + DMSO para usar nessas diluições com base no volume necessário para diluir todas as cepas.
   3. Misture a cultura e LB + DMSO por vórtice.
7. Para manter as culturas em uma concentração constante de DMSO, realize diluições seriais dez vezes maiores das culturas normalizadas durante a noite em PBS + DMSO.
   1. Faça uma solução estoque de PBS + DMSO. Para um conjunto de diluições para uma cepa, misture 300 μM de volume de DMSO com PBS para obter um volume total de 720 μl. Aumente ou diminua a escala dessas ações, dependendo de quantas cepas são testadas.
   2. Rotule os tubos de microcentrífugas para diluições seriais ^{de 10-1} a ^10-7. Adicione 90 μl de PBS + DMSO aos tubos apropriados. Use PBS + DMSO para cepas cultivadas em LB + DMSO.
   3. Adicionar 10 μl de cultura ao tubo de diluição ^10-1 adequado. Misturar por vórtice e transferir 10 μl da diluição ^10-1 para o tubo de diluição ^10-2. Repita até que todas as diluições tenham sido realizadas. Troque as pontas da pipeta entre as diluições.
8. Localize 5 μl das diluições ^10-3 a ^10-7 em placas LB + H₂O₂ em duplicata para cada cepa. Use uma ponta de pipeta se as manchas forem revestidas do mais diluído para o menos diluído (^10-7 a ^10-3). Não incline ou incline a placa até que o líquido tenha secado na placa.
9. Incubar as placas por 24-48 horas a 37 °C (incubadora de ar), dependendo da cepa.
   NOTA: P. aeruginosa PAO1 terá colônias de bom tamanho em LB após 24 horas de incubação. Incube as cepas até que tenham colônias aproximadamente do mesmo tamanho que PAO1.
10. Fotografe as placas usando uma câmera CCD acima de um transluminador. Opcionalmente, edite as fotos para contraste e corte-as no mesmo tamanho. Conte o número de colônias em cada ponto para determinar as mudanças na sensibilidade ao estresse oxidativo.

Tabela 1: Concentrações de H₂O₂ para adicionar ao ágar LB para o ensaio de placa pontual de estresse oxidativo. Esta tabela fornece várias concentrações de H₂O₂ e a quantidade correspondente de estoque concentrado de H₂O₂ para adicionar a 100 ml de ágar LB.

Concentração final de H2O2 (mM)	Quantidade de 9,79 M H2O2 (30% em peso) a adicionar (μl)
0	0
0,2	2.04
0,4	4.09
0,6	6.13
0,8	8.17
1	10.21

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanodiona (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Também chamado de nitisinona. Solúvel em DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30% em peso em H2O. Estabilizado.