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1. Cepa bacteriana e meio de crescimento
- Faça albumina dextrose e solução estoque de sal (ADS) solubilizando 25 g de albumina de soro bovino, 10,0 g de dextrose e 4,05 g de cloreto de sódio em 460 mL de água deionizada. Esterilize o ADS com filtro e armazene-o a 4 °C.
- Faça o caldo 7H9 adicionando 4,7 g de pó 7H9 e 2 mL de glicerol a 900 mL de água purificada. Autoclave o caldo 7H9 a 121 °C durante 10 min e deixe-o arrefecer até à temperatura ambiente antes de prosseguir. Faça 7H9ADST adicionando 100 mL de ADS e 0,5 mL de Tween80 a 900 mL de caldo 7H9. Conservar a 4 °C.
- Pesar 50 mg de sulfato de canamicina e dissolvê-lo em 1 mL de água deionizada; a concentração final é de 50 mg/mL. Filtrar-esterilizar e conservar a -20 °C. Adicionar 0,5 ml de solução-mãe de canamicina por 1 L de 7H9ADST.
nota: Este meio deve ser feito fresco, portanto, dimensione os volumes adequadamente de acordo com o tamanho da cultura.
- Cultivar M. tuberculosis em 7H9ADST suplementado com canamicina em cultura em pé. Agite a cultura diariamente e dilua-a antes que o OD600 atinja 1,0 para evitar aglomeração.
nota: A cepa de M. tuberculosis utilizada para o desenvolvimento deste método foi transformada em H37Rv com plasmídeo pJAK2.A. pJAK2.A é um plasmídeo integrativo baseado no vetor pMV361, que permite a expressão de alto nível do gene da luciferase do vaga-lume do promotor hsp60 e pode ser selecionado usando canamicina.
2. Análise da atividade no caldo usando um ensaio de resazurina
- Cultive M. tuberculosis em 7H9ADST até a fase intermediária (~ 0,5 - 0,8 OD600). Diluir a cultura com o 7H9ADST a 0,01 OD600. Diluir os compostos em 7H9ADST até 2x as concentrações de ensaio e alíquota de 100 μL de cada composto diluído em cada alvéolo.
- Transferir 100 μL da suspensão bacteriana diluída para cada alvéolo. Deixe as placas incubarem a 37 °C em uma incubadora umidificada por 5 dias. Dissolva 10 mg de resazurina em 100 mL de água deionizada e um filtro estéril.
- Adicione 30 μL de solução de resazurina e monitore a mudança de cor após 48 h; o crescimento bacteriano é indicado por uma conversão de cor de azul para rosa.
nota: Uma análise quantitativa também pode ser realizada medindo a fluorescência a 590 nm com excitação em 530 - 560 nm ou a absorbância em 570 nm e 600 nm.