Avaliando a eficácia de um composto de teste contra micobactérias em caldo

Resumo

Fonte: Zheng, X., et al. Sistema de Triagem de Eficácia e Citotoxicidade de Inibidores Direcionados ao Mycobacterium tuberculosis Intracelular. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra um ensaio em caldo para determinar a eficácia do antibiótico contra o Mycobacterium tuberculosis. A cultura bacteriana é incubada com diferentes concentrações de um antibiótico bactericida. A eficácia bactericida é medida avaliando a presença de bactérias viáveis usando um ensaio de resazurina.

Protocolo

1. Cepa bacteriana e meio de crescimento

1. Faça albumina dextrose e solução estoque de sal (ADS) solubilizando 25 g de albumina de soro bovino, 10,0 g de dextrose e 4,05 g de cloreto de sódio em 460 mL de água deionizada. Esterilize o ADS com filtro e armazene-o a 4 °C.
2. Faça o caldo 7H9 adicionando 4,7 g de pó 7H9 e 2 mL de glicerol a 900 mL de água purificada. Autoclave o caldo 7H9 a 121 °C durante 10 min e deixe-o arrefecer até à temperatura ambiente antes de prosseguir. Faça 7H9ADST adicionando 100 mL de ADS e 0,5 mL de Tween80 a 900 mL de caldo 7H9. Conservar a 4 °C.
3. Pesar 50 mg de sulfato de canamicina e dissolvê-lo em 1 mL de água deionizada; a concentração final é de 50 mg/mL. Filtrar-esterilizar e conservar a -20 °C. Adicionar 0,5 ml de solução-mãe de canamicina por 1 L de 7H9ADST.
   nota: Este meio deve ser feito fresco, portanto, dimensione os volumes adequadamente de acordo com o tamanho da cultura.
4. Cultivar M. tuberculosis em 7H9ADST suplementado com canamicina em cultura em pé. Agite a cultura diariamente e dilua-a antes que o OD₆₀₀ atinja 1,0 para evitar aglomeração.
   nota: A cepa de M. tuberculosis utilizada para o desenvolvimento deste método foi transformada em H37Rv com plasmídeo pJAK2.A. pJAK2.A é um plasmídeo integrativo baseado no vetor pMV361, que permite a expressão de alto nível do gene da luciferase do vaga-lume do promotor hsp60 e pode ser selecionado usando canamicina.

2. Análise da atividade no caldo usando um ensaio de resazurina

1. Cultive M. tuberculosis em 7H9ADST até a fase intermediária (~ 0,5 - 0,8 OD600). Diluir a cultura com o 7H9ADST a 0,01 OD₆₀₀. Diluir os compostos em 7H9ADST até 2x as concentrações de ensaio e alíquota de 100 μL de cada composto diluído em cada alvéolo.
2. Transferir 100 μL da suspensão bacteriana diluída para cada alvéolo. Deixe as placas incubarem a 37 °C em uma incubadora umidificada por 5 dias. Dissolva 10 mg de resazurina em 100 mL de água deionizada e um filtro estéril.
3. Adicione 30 μL de solução de resazurina e monitore a mudança de cor após 48 h; o crescimento bacteriano é indicado por uma conversão de cor de azul para rosa.
   nota: Uma análise quantitativa também pode ser realizada medindo a fluorescência a 590 nm com excitação em 530 - 560 nm ou a absorbância em 570 nm e 600 nm.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson e Companhia	Rolamento 271210
Interpolação80	Fisher Científico	T164
Albumina bovina pH7	Affymetrix	Rolamento 10857
dextrose	Fisher Científico	BP350
cloreto de sódio	Fisher Científico	BP358
sulfato de canamicina	Fisher Científico	BP906
Resazurina	Alfa Aesar	B21187
Glicerol	Fisher Científico	BP229
M. tuberculosis H37Rv
Placa branca de fundo plano de 96 poços	Corning	3917
Placa transparente de fundo plano de 95 poços	Corning	3595
Seladora de placas transparente	Thermo Fisher Científico	AB-0580
Luminómetro	Biossistemas Aplicados	Tropix TR717