Medição de TEER em células epiteliais irradiadas por raios-X co-cultivadas com PBMCs

Resumo

Fonte: Babini, G., et al. Um método de co-cultura para investigar a diafonia entre células Caco-2 irradiadas por raios-X e PBMC. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a medição da resistência elétrica transepitelial em células Caco-2 irradiadas, tanto na presença quanto na ausência de células PBMC. Este método permite o estudo dos efeitos sinérgicos da radiação e das células imunes na barreira celular epitelial.

Protocolo

1. Configuração de irradiação

Nota: A irradiação de células Caco-2 foi realizada no departamento de radioterapia do Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Pavia, Itália) com um acelerador linear usado rotineiramente para tratar diferentes tipos de câncer.

1. Defina a energia de raios-X do fóton para o pico de 6 MV. O acelerador linear opera em regime de pulsação (tempo entre dois pulsos consecutivos de aproximadamente 4 ms; duração de um único pulso de cerca de 5 μs com uma taxa de dose de até 1 × ^10-3 Gy/p).
2. Coloque as placas de 6 poços contendo insertos com Caco-2 na trajetória dos raios X em uma folha de acrílico de 1,4 cm de espessura (correspondendo a uma distância ligeiramente maior que o acúmulo da radiação usada) a 100 cm da fonte de radiação.
3. Coloque um bolus de 0,5 cm de espessura em cada amostra antes que a irradiação ocorra para garantir o componente de radiação retroespalhada e o equilíbrio das partículas carregadas.
4. Irradiar as células (doses na faixa de 2 a 10 Gy) com um campo de radiação plano e simétrico (± 2%) 20 x 20 cm₂ e uma taxa de dose de 3 Gy/min.
   nota: As células controle irradiadas "sham" foram submetidas às mesmas condições de procedimento das irradiadas, sem entrar na sala de irradiação (dose recebida: 0 Gy).
   cuidado: Os dispositivos produtores de radiação ionizante devem ser utilizados apenas por pessoal especializado.

2. Resistência Elétrica Transepitelial (TEER)

1. Semeie 5 × 10⁵ células Caco-2 uma semana antes da irradiação em insertos de co-cultura em placas de 6 poços (tereftalato de polietileno (PET), 2 x 10⁶ poros / cm2).
2. 1 h antes da irradiação, medir o TEER com um voltímetro/ohmímetro.
3. Irradie as células conforme descrito nas etapas 1.1 - 1.4.
4. Incubar células de Caco-2 na presença/ausência de co-cultura com PBMC a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂.
5. Nas primeiras horas após a irradiação, meça o TEER a cada hora e, posteriormente, a cada 3 horas até 48 horas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ThinCert 6 Well Cell Culture Inserts para placas multipoços	Greiner Bio-one	Nº 657610	equipamento
Placa Multipoços para Cultura de Células, 6 Poços	Greiner Bio-one	Nº 657160	plástico
Placa Multipoços para Cultura de Células, 24 Poços	Greiner Bio-one	Nº 662160	plástico
RPMI 1640 sem L-Glutamina	Lonza	12-167F	Reagentes
Voltímetro/ohímetro Millicell-ERS	Millipore	MERS 00001	equipamento