Um ensaio de biofilme de placa de Peg para triagem de agentes antibacterianos

Resumo

Fonte: Dalecki, A. G., et al. Direcionamento de Staphylococcus aureus associado a biofilme usando ensaio de suscetibilidade a drogas baseado em resazurina. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra um ensaio para triagem de compostos antimicrobianos que eliminam biofilmes com eficiência usando uma placa de pino. A metodologia monitora o estado metabólico do biofilme após o tratamento com compostos antimicrobianos, facilitando a determinação da concentração mínima de erradicação do biofilme.

Protocolo

1. Iniciação do Biofilme

1. Cultive uma cultura de organismos produtores de biofilme em um meio rico em nutrientes. Inocular Staphylococcus aureus estirpe Newman em 10 ml de meio Mueller-Hinton de um stock de glicerol. Realizar todo o trabalho que envolva o manuseio de S. aureus com luvas e dentro de um gabinete de biossegurança.
2. Incubar durante 16 horas a 37 °C num agitador rotativo (100-200 rpm).
3. Determinar a DO₆₀₀ da cultura utilizando um espectrofotómetro e uma cubeta padrão (comprimento do trajeto: 1 cm).
4. Calcular o volume (V) de cultura necessário para preparar 20 ml de inóculo com OD_{600 (inóculo)} de 0,1 em meio queléxico do Roswell Park Memorial Institute (CRPMI) utilizando a fórmula: [V = 20 ml*0,1/OD_{600(cultura)]}.
   1. Adicione o volume de cultura calculado (de cima) a um tubo de centrífuga e células de pellets girando por 1 min a 10.000 x g. Para preparar o inóculo de biofilme, aspirar o meio de crescimento gasto e ressuspender o sedimento celular em 20 ml de CRPMI.
5. Despeje o inóculo em um reservatório de 25 ml.
6. Remova cuidadosamente a tampa de uma placa de pinos estéril de 96 poços, puxando-a para cima.
   Nota: Deve-se tomar cuidado para não contaminar os pinos pendurados na tampa. A tampa pode ser colocada de cabeça para baixo em uma superfície limpa dentro de um armário de biossegurança.
7. Utilizando uma pipeta multicanal de 200 μl, adicionar 125 μl de inóculo a cada alvéolo das filas A a G da placa inferior.
8. Encher 125 μl de meio CRPMI estéril em cada alvéolo da fileira H como controlo de esterilidade.
9. Pegue a tampa do pino e segure-a acima do fundo da placa com os pinos voltados para baixo. Alinhe cuidadosamente os pinos individuais com seus respectivos poços. Evite o contato físico entre a placa e os pinos. Uma vez alinhada, abaixe a tampa com cuidado. Evite desalinhamentos, pois os reajustes realizados após os pinos terem tocado a placa inferior podem contaminar os controles de esterilidade na linha H.
10. Sele a tampa da placa com filme de parafina para evitar a evaporação e coloque-a em um saco plástico lacrável, selando bem. Mantenha o volume de ar no saco o mais baixo possível para minimizar a evaporação.
11. Incubar sem agitar a 37 °C por 48 horas em uma incubadora de CO₂ a 5%
    Nota: 48 horas de crescimento foram ideais para S. aureus, mas variam de acordo com o organismo usado.
    nota: Embora a incubação estática seja um bom ponto de partida para otimizar o ensaio, agitar suavemente a 150 rpm em um agitador de microplacas é uma variação possível que pode aumentar a formação de biofilme de alguns isolados de S. aureus.

2. Preparação da Placa de Provocação de Biofilme

1. No dia do desafio do biofilme, pegue uma nova placa de 96 poços e adicione 100 μl de CRPMI, equilibrado a RT, a cada poço das linhas B a H. Para evitar resultados inconsistentes, utilize uma placa de 96 poços que possa conter 200 μl de meio quando os pinos estiverem dentro e apresente poços com dimensões idênticas às da placa de iniciação do biofilme.
2. Diluir até 4 compostos de teste separadamente em 1,0 ml de CRPMI até 2x a concentração final desejada, a fim de contabilizar uma diluição final na etapa 2.7.
   Nota: Um bom ponto de partida é 8 vezes acima da concentração inibitória das células planctônicas.
3. Adicione 200 μl do composto 1 nos poços A1 a A3, do composto 2 nos poços A4 a A6, do composto 3 nos poços A7 a A9 e do composto 4 nos poços A10 a A12.
4. Diluir em série os compostos de ensaio utilizando uma pipeta multicanal e transferir 100 μl da linha A para a linha B e homogeneizar.
5. Dessa forma, continue a transferir 100 μl de poço para poço. Misturar após cada transferência e parar na linha F.
6. Após a mistura, expulsar 100 μl da fileira F para um recipiente de resíduos. Não transfira nenhum líquido para as fileiras G e H.
7. Adicione 100 μl de CRPMI a cada poço da placa usando uma pipeta multicanal para trazer o volume para 200 μl. Consulte a Figura 1 para obter o layout final da placa.

3. Desafio do Biofilme

1. Adicione 200 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma placa fresca e estéril de 96 poços que apresente poços com dimensões idênticas às da placa de iniciação do biofilme.
2. Remova o saco plástico e o filme de parafina da placa de iniciação de biofilme incubada.
3. Levante a tampa para cima. Evite o contato entre os pinos e o fundo da placa, pois isso pode danificar o biofilme. Guarde a parte inferior para a análise subsequente do OD₆₀₀ (ver 3.8).
4. Enxágue as células planctônicas colocando a tampa do pino na placa contendo PBS (da etapa 3.1). Mergulhe os pinos por 5 segundos, retire o PBS e mergulhe mais uma vez, tomando cuidado para não bater nos pinos contra os lados do poço.
5. Coloque a tampa do pino enxaguada na placa de desafio. Evite o contato desnecessário entre os pinos e a placa inferior, pois isso danificará o biofilme, levando a resultados inconsistentes.
6. Sele a placa com filme de parafina e coloque-a em um saco plástico lacrável conforme descrito na etapa 1.10.
7. Incubar a placa sem agitar durante 24 horas a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5%.
8. Pegue a parte inferior da placa de iniciação do biofilme de 3.3. Ressuspenda as bactérias em cada poço usando uma pipeta multicanal e meça o OD₆₀₀ com um leitor de microplacas adequado para confirmar o crescimento que ocorre em todos os poços, exceto nos controles de esterilidade na linha H.

4. Determinação do biofilme

1. Utilizar um leitor de placas equipado com uma câmara de incubação e capaz de efectuar leituras cinéticas de fluorescência para detectar a conversão da resazurina. Configure uma medição de fluorescência cinética de 24 horas usando uma excitação de 530 nm e emissão de 590 nm.
2. Ajuste a temperatura da câmara para 37 °C e faça com que a placa seja lida a cada 20 minutos. Ajuste o leitor de placas para medir a partir do fundo da placa de acordo com as instruções do fabricante.
3. Prepare a placa de lavagem adicionando 200 μl de PBS com uma pipeta multicanal a uma placa estéril de 96 poços.
4. Preparar o meio de recuperação de biofilme adicionando 400 μl de solução-mãe de resazurina a 0,8 mg/ml a 20 ml de meio CRPMI até uma concentração final de 16 μg/ml de resazurina.
   nota: A resazurina é um irritante cutâneo conhecido. Use um jaleco, óculos de proteção e luvas durante o manuseio. O CRPMI como meio de recuperação de biofilme foi usado porque fornece o sinal de fundo mais baixo, mas pode ser substituído por meio Mueller Hinton, se apropriado.
5. Adicione 150 μl de meio de recuperação de biofilme com uma pipeta multicanal a cada poço de uma placa nova de 96 poços.
6. Transfira a placa de desafio da incubadora para um gabinete de biossegurança e remova cuidadosamente o saco plástico e o filme de vedação.
7. Retirar a tampa da cavilha de provocação e enxaguar as células planctónicas em PBS como descrito em 3.4. Guarde a parte inferior da placa de desafio para a análise subsequente do OD₆₀₀ (ver 4.10).
8. Após o enxágue, coloque a tampa do pino no fundo da placa contendo o meio de recuperação de biofilme.
9. Enrole a lateral da placa com filme de parafina, tomando cuidado para não obstruir o fundo dos poços perimetrais. Imediatamente após embrulhar a placa, coloque-a no leitor de placas e inicie uma leitura cinética durante um período de 24 horas, iniciando o protocolo cinético de resazurina feito anteriormente a partir da etapa 4.1.
10. Para quantificar o crescimento de células planctônicas que podem ou não ocorrer durante o desafio, leia o OD₆₀₀ de todo o fundo da placa de desafio usando um leitor de microplacas. Siga as instruções fornecidas no passo 3.8.
    Nota: Ressuspenda cuidadosamente o conteúdo de cada poço, pois as células que se desprendem do biofilme tendem a crescer em aglomerados no fundo do poço. Quaisquer bolhas dentro do poço interferirão fortemente nas leituras do OD₆₀₀ e devem ser evitadas ou removidas antes da leitura.

Resultados

Figura 1. Layout da placa de desafio. Exemplo de layout de placa de desafio que acomoda testes paralelos de quatro compostos em triplicado em seis concentrações distintas. Controles não tratados e de esterilidade também estão incluídos. O design do layout suporta a preparação conveniente na placa de diluições seriais usando uma pipeta multicanal. As concentrações estão em μM.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mueller-Hinton Médio	Oxóide	CM0405	Siga as recomendações do fabricante
RPMI-médio	Corning	17-105-CV
CRPMI	Referência 9		RPMI-1640 médio quelexo por 1 hora com resina Chelex 100 e depois suplementado com 10% de desquelex RPMI-1640
Resina Chelex 100	Bio Rad	142-2822
Placas de MBEC	Innovotech	Rolamento 19111
Sal de sódio de resazurina	sigma	R7017	800 μg/ml em água DI Filtro estéril
Plataforma de agitação de micro placas	Heidolph Titramax 1000
Leitor de placas Cytation 3	Biotek
Software Gen5	Biotek		Registro e análise da conversão de resazurina
Neocuproína	sigma	N1501	Preparar estoque 10 mM em 100% Etanol, armazenar a -80 ºC
Sulfato de cobre	Acros Orgânicos	Rolamento 7758-99-8	Preparar uma solução-mãe a 100 mM em água, conservar a 4 ºC
-Neocuproína	Feito por você mesmo		Gerado pela mistura de molaridades iguais de neocuproína e sulfato de cobre. A mistura foi diluída em meio CRPMI até a concentração desejada.
gentamicina	sigma	G3632-1G