1. Preparação
- Revestimento celular
nota: Células epiteliais cervicais humanas, HeLa e HeLa expressando histona 2B-GFP (H2B-GFP), foram utilizadas neste protocolo, mas este ensaio pode ser adaptado a outras células de mamíferos.
- Separe as células aderentes de um frasco de cultura de2 células de 75 cm lavando as células com 2 mL de tripsina-EDTA 0,25%. Substitua a tripsina usada por 2 mL de tripsina-EDTA 0,25% fresca.
- Incubar as células a 37 °C durante 5 minutos até que estas se arredondem e se desprendam do balão.
- Ressuspenda as células em 8 mL de meio de crescimento (DMEM contendo 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor, 100 U / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina).
- Determinar a concentração celular usando um hemocitômetro e 10 μL de suspensão celular.
- Diluir as células em um meio de crescimento até uma concentração de 2,5 x 105 células/mL.
- Despeje a suspensão celular em uma bacia de pipeta estéril e misture bem a suspensão usando uma pipeta sorológica de 10 mL.
- Usando uma micropipeta multicanal de 12 e ponteiras de 200 μL, distribua as células HeLa (2,5 x 104 células/100 μL/poço) em triplicado (ou quadruplicado) em uma placa de 96 poços, plana, de fundo transparente, tratada com cultura de tecidos de poliestireno preto.
nota: Um arranjo de revestimento é apresentado como exemplo na Figura 1.
- Cultivar as células durante 24 h numa incubadora de cultura de células humidificada a 37 °C e 5% de CO2.
- Preparação da solução de estoque
- Prepare 1 L de um estoque de 10x de tampão M (usado para preparar M1 e M2) adicionando 95 g de Hanks Balanced Salt Solution, 0,476 g de MgCl2 (5 mM) e 23,83 g de HEPES (100 mM) a 900 mL de água. Ajuste o pH para 7,4 e aumente o volume para 1 L. Filtre esterilizar.
- Prepare 50 mL de um estoque de glicose de 50x (1,25 M) adicionando 11,26 g de D-(+)-Glicose a um total de 50 mL de água. Filtre e esterilize a solução.
- Prepare 50 mL de um estoque de cálcio de 100x (120 mM) adicionando 0,666 g de CaCl2 a um total de 50 mL de água. Filtre e esterilize a solução.
- Prepare 50 mL de um estoque de 10x (50 mM) de etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N', ácido tetracético (EGTA) adicionando 0,951 g de EGTA a 40 mL de água. Aumente o pH para 8 usando NaOH para dissolver o EGTA e, em seguida, aumente o volume para 50 mL. Filtre e esterilize a solução.
- Para uma única placa de 96 poços, prepare 50 mL de Meio 1 (M1, contém Ca2+), 50 mL de Meio 2 (M2, livre de Ca2+) e 15 mL de Meio 2 suplementado com EGTA, de acordo:
- Para M1, adicione 5 mL de 10x Buffer M, 0,5 mL de 100x CaCl2 e 1 mL de 50x glicose a 43,5 mL de água.
- Para M2, adicione 5 mL de 10x Buffer M e 1 mL de 50x glicose a 44 mL de água.
- Para M2/EGTA, adicione 1,5 mL de 10x Buffer M e 1,5 mL de 10x EGTA a 12 mL de água.
nota: Todas as soluções contendo iodeto de propídio (PI) devem ser preparadas diretamente antes de serem adicionadas às células.
- Configurações do leitor de placas/citômetro de imagem
nota: Use um leitor de placas multimodo equipado com duas unidades de detecção: um espectrofluorômetro e um citômetro de imagem. Limite a exposição à fluorescência para evitar o fotobranqueamento dos fluoróforos.
- Pré-aqueça o leitor de placas a 37 °C antes de realizar o ensaio.
- Configure os parâmetros para o ensaio cinético de acordo com o modo Configurações:
- Escolha Monocromador, FL (fluorescência) e Cinético para a configuração óptica, modos de leitura e tipo de leitura, respectivamente.
- Em Configurações de comprimento de onda, selecione uma passagem de banda de excitação e emissão de 9 e 15 nm, respectivamente. Para ensaios com iodeto de propídio (PI), definir os comprimentos de onda de excitação e emissão para 535 e 617 nm, respectivamente.
- Em Tipo de placa, selecione 96 poços para o formato de placa e uma configuração de placa predefinida correspondente a uma placa de fundo transparente de parede preta.
- Em Área de Leitura, destaque os poços que serão analisados ao longo da cinética.
- Em PMT e Óptica, predefina os flashes por leitura para 6 e marque a caixa Ler de baixo.
- Em Tempo, insira 00:30:00 na caixa Tempo Total de Execução para um ensaio cinético de 30 minutos e insira 00:05:00 para o Intervalo.
Nota: Para cada ponto de tempo e um comprimento de onda, o tempo de leitura de uma placa completa de 96 poços é de 30 s.
- Confirme as configurações especificadas nas Informações de configurações à direita e selecione OK. Pressione Ler para iniciar a execução cinética.
- Configure os parâmetros de imagem de acordo com o modo Configurações:
- Escolha Minimax, Imaging e Endpoint para a configuração óptica, modos de leitura e tipo de leitura, respectivamente.
- Em Comprimentos de onda, selecione a luz transmitida e uma ou ambas as caixas de fluorescência correspondentes aos comprimentos de onda de excitação e emissão de 456/541 nm (GFP) e 625/713 nm (PI).
- Use as mesmas opções para o Tipo de placa e Área de leitura, conforme definido nas etapas 1.3.2.3 e 1.3.2.4.
- Em Configuração da área do poço, selecione o número de locais dentro de um poço a ser fotografado.
Nota: 12 locais correspondem a uma imagem de poço completo.
- Em Configurações de aquisição de imagem, selecione os tempos de exposição para luz transmitida, 541 (GFP) e 713 (PI). Para GFP, crie imagens de todo o poço com um tempo de exposição de 20 ms/imagem. Para luz transmitida (TL) e fluorescência PI, adquira uma única imagem do centro de cada poço com tempos de exposição de 8 e 20 ms, respectivamente.
- Confirme as configurações especificadas nas Informações de configurações à direita e selecione OK. O tempo de aquisição para obter imagens de toda a superfície de cada poço (12 imagens/poço) de uma placa de 96 poços e para um comprimento de onda é de ~ 15 min. Pressione Ler para iniciar a imagem.
Nota: O tempo de aquisição de uma única imagem/poço de uma placa de 96 poços requer ~2,5 min/placa para um comprimento de onda. Os parâmetros descritos acima correspondem ao equipamento específico do nosso laboratório. Medições espectrofluorométricas: Uma lâmpada de flash de xenônio exibindo comprimentos de onda de excitação de incremento de 1,0 nm (250-850 nm) com uma passagem de banda ajustável de 9 ou 15 nm, um detector de tubo fotomultiplicador com uma faixa dinâmica de > 6 log e uma passagem de banda de emissão ajustável de 15 ou 25 nm. Citômetro de imagem: Uma fonte de luz de iluminação capaz de luz branca, comprimentos de onda de excitação de 460 nm e 625 nm com uma passagem de banda de 20 nm, filtros de emissão centrados em 541 nm (passagem de banda de 108 nm) e 713 nm (passagem de banda de 123 nm), respectivamente, e uma objetiva 4X acoplada a uma câmera de dispositivo de carga acoplada de 1.25 megapixels de 12 bits.
2. Ensaio
Nota: No momento do ensaio, as células devem ser 70-90% confluentes. Durante as etapas de lavagem, o meio deve ser removido e aplicado na parede lateral do poço (não diretamente acima das células). Manter a temperatura do LLO a < 4 °C para evitar a sua agregação até ao passo 3.1.5.
- Preparar uma reserva de 30 μM de PI em M1 e uma reserva de 30 μM de PI em M2 pré-aquecida a 37 °C.
- Lave suavemente as células da placa 1 usando uma micropipeta multicanal de 12 e pontas de 200 μL, da seguinte forma:
- Para condições de reparação, remover o meio de cultura e lavar as células duas vezes com 200 μL/alvéolo M1 pré-aquecido a 37 °C. Substituir o meio por 100 μL/alvéolo de M1 quente contendo 30 μM de PI.
- Para condições restritivas de reparo, remova o meio de crescimento e lave as células uma vez com 200 μL / poço quente M2 contendo 5 mM EGTA para quelar Ca2+, seguido de uma lavagem com 200 μL / poço M2. Substitua o meio por 100 μL / M2 bem quente contendo 30 μM PI.
- Depois de o meio de cultura ter sido lavado e substituído por um meio que contenha iodeto de propídio, passar directamente para o passo 2.1.3.
- Placa de imagem 1 sob luz transmitida, GFP e PI conforme detalhado em 1.3.3 (pré-cinético). Esta etapa leva de 15 a 20 minutos.
- Durante o período de 15 minutos na etapa 2.1.3, prepare a placa 2 usando uma micropipeta multicanal de 12 e ponteiras de 200 μL da seguinte forma:
- Coloque uma microplaca de polipropileno de fundo redondo de 96 poços no gelo. Configure a placa usando um projeto experimental correspondente à placa 1 (Figura 1).
- Para condições permissivas de reparo, adicione 100 μL / poço de M1 gelado contendo 60 μM PI, seguido pela adição de 100 μL / poço de M1 gelado contendo 4x LLO ou não para o controle.
- Para condições restritivas de reparo, adicione 100 μL/poço de M2 gelado contendo 60 μM PI, seguido pela adição de 100 μL/poço de M2 gelado contendo 4x LLO ou não para o controle.
- Após a placa de imagem 1 (etapa 2.1.3), coloque-a imediatamente no gelo, usando papel alumínio para separar a placa do contato direto com o gelo. Deixe a placa 1 esfriar por 5 min.
- Usando uma micropipeta multicanal de 12 e pontas de 200 μL, transfira 100 μL de cada poço para a placa 2 (etapa 2.1.4) para os poços correspondentes na placa 1. Para distribuir adequadamente a toxina no meio da placa 1, insira as pontas abaixo do menisco e ejete suavemente o volume sem introduzir bolhas.
Nota: Não pipete para cima e para baixo, pois isso pode separar inadvertidamente as células.
- Deixe a placa por mais 1 min para permitir que a toxina se ligue às células e transfira imediatamente a placa 1 para o leitor de placas para o ensaio cinético usando o modo espectrofluorômetro (etapa 1.3.2).
- No final do ensaio cinético, obter imediatamente a imagem da placa 1 (pós-cinética) utilizando o passo 1.3.3.
3. Análise: Enumeração de Células
- Determine a contagem de células com base na fluorescência nuclear usando o software de enumeração de células de microplacas.
- Em Configurações, selecione Reanálise e, na seção de categoria nas Configurações de análise de imagem, selecione Análise discreta de objetos usando 541 como comprimento de onda para localizar objetos.
- Na opção Localizar objetos, usando o método de localização Desenhar em imagens, selecione Núcleos na guia de configurações e pressione Aplicar.
- Pressione OK e Read para iniciar o algoritmo de contagem de células.
