Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Fixação de tecidos em formalina
- Coloque 3-5 mm de tecidos cerebrais coletados após a necropsia em solução de formalina tamponada com fosfato a 10% (proporção tecido/formalina de 1:20 a 1:50) por 24-72 h.
cuidado: A formalina é um fixador tóxico.
- Registre o peso aproximado do tecido (tamanho), tipo de tecido (áreas cerebrais) e volume de formalina. É importante que os laboratórios documentem e mantenham registros sobre os tempos de fixação.
- Para um armazenamento mais longo do tecido após a fixação da formalina e antes do processamento, coloque o tecido em etanol a 70%.
2. Processamento de tecidos
- Após a fixação da amostra, disseque o tecido para incluir as áreas cerebrais importantes, por exemplo, seções transversais do tronco cerebral, cerebelo (3 lobos) ou hipocampo (ambos hipocampos), cada um cortado com 3 a 5 mm de espessura e colocado em de processamento.
- Processe os de tecido para infiltração de cera de parafina, embutidos em blocos de parafina e seccionados (3 a 6 μm) em um micrótomo.
3. Preparação de Materiais / Pratos de coloração
- Configure a placa de coloração (Tabela de Materiais) conforme mostrado na Figura 1. Encha cada prato com 250 mL da solução.
- Preparação da solução-mãe de substrato 3-amino-9-etilcarbizol (AEC)
- Dissolva um comprimido de 20 mg de 3-amino 9-etilcarbazol (AEC) em 5 ml de N,N, dimetilformamida utilizando uma pipeta de vidro.
cuidado: AEC é cancerígeno.
- Preparação da solução-mãe de protease (por exemplo, Pronase) para a recuperação do antígeno
- Dissolva 7 mg da protease em 200 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Preparação do tampão de enxágue PBS-T
- Adicione 10 mL de Tween 80 a 990 mL de PBS. Misture bem para formar uma solução homogênea.
4. Desparafinização e reidratação tecidual
- Fazer uma secção de parafina de 5 μm com um micrótomo, flutuar num banho-maria a 38 °C e recolhê-la em lâminas de vidro. Rotule as lâminas com uma caneta/marcador resistente a reagentes.
- Coloque as lâminas em uma bandeja e derreta em um forno a 55-60 °C por 1 hora. Não aumente a temperatura acima de 60 °C, pois pode destruir o antígeno viral.
- Retire as lâminas do forno e desparafinize imediatamente em 3 enxágues consecutivos de xileno de 5 min cada nos pratos 1, 2 e 3.
- Reidrate as secções na lâmina por imersões sequenciais em diluição decrescente de etanol em água desionizada: (4 a 11 é um enxaguamento por imersão) Cápsula 4: xileno/etanol a 100% (1:1); Cápsula 5: 100% de etanol; Cápsula 6: 100% de etanol; Cápsula 7: Etanol a 95%; Cápsula 8: Etanol a 95%; Cápsula 9: Etanol a 80%; Cápsula 10: Etanol a 70%; Cápsula 11: água deionizada (Figura 1. Configuração do prato).
cuidado: O xileno é um produto químico perigoso e o trabalho deve ser realizado em uma capela de exaustão.
5. Recuperação do antígeno proteolítico
- Trate as lâminas com a protease (2,5 μg/mL de PBS) por 30 min para recuperação do antígeno proteolítico na placa 12.
- Em seguida, enxágue em PBS-T por 10 min (prato 13).
- Trate com peróxido de hidrogênio a 3% por 10 min (prato 14).
- Novamente, lave com PBS-T por 10 min (prato 15).
6. Procedimento de coloração
- Manuseie as lâminas uma de cada vez, mantendo as lâminas restantes submersas no buffer (não remova todo o suporte da lâmina - mantenha as lâminas molhadas). Remova uma lâmina e limpe o excesso de tampão (usando uma toalha de papel) ao redor da seção de tecido, tomando cuidado para não perturbar a seção de tecido. Incube as lâminas em uma câmara de umidade, feita colocando toalhas de papel umedecidas, na bancada do laboratório em temperatura ambiente com soro de cabra normal (bloqueio) por 15 min.
- Incubar com o anticorpo antirrábico primário de diluição pré-determinada ideal (diluição 1:250 do soro antirrábico de ratinho, não publicado) (controlo positivo) e anticorpos de controlo negativo à temperatura ambiente igual à anterior (passo 6.1.) durante 60 minutos sem lavagens intermédias.
- Após 60 min, lave com PBS-T por 10 min (prato 16).
- Incubar com o anticorpo biotinilado (específico da espécie) numa câmara de humidade à temperatura ambiente durante 15 min (manuseamento igual ao passo 6.1).
- Lave com PBS-T por 10 min (prato 16).
- Incubar com o complexo estreptavidina-peroxidase de rábano (HRP) em uma câmara de umidade à temperatura ambiente por 15 min (manuseio igual ao 6.1.).
- Lave com PBS-T por 10 min (prato 16).
- Incubar com substrato de peroxidase, amino-etilcarbazol (AEC), em uma câmara de umidade em temperatura ambiente por 10 min. Faça AEC imediatamente antes de usar. Para fazer isso, adicione 1 mL de solução estoque AEC a 14 mL de tampão acetato 0,1M, pH 5,2. Adicione 0,15 mL de peróxido a 3%, H2O2. Filtre a mistura imediatamente antes de usar (filtro de 0,45 μm).
nota: A solução de trabalho do AEC é estável apenas por 2-3 horas. A solução estoque AEC pode ser armazenada na geladeira por períodos mais longos.
- Lave em água deionizada por 10 min (prato 17)
- Contracorado com Hematoxilina de Gill diluído 1:2 com água deionizada por 2 min (placa 18).
- Enxágue o excesso de hematoxilina com água deionizada e enxágue por imersão (pratos 19 e 20).
- Enxágüe em água da torneira Scott por 30 s (solução azulada) prato 21.
- Lave em água deionizada por 10 min (prato 22)
- Remova as lâminas uma de cada vez - monte com um meio de montagem solúvel em água.
- Leia as lâminas em um microscópio de luz.
