Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação histopatológica e processamento após a obtenção da biópsia da artéria temporal
NOTA: A biópsia da artéria temporal (TAB) é realizada sob anestesia local e condições estéreis por um cirurgião certificado. Após a obtenção cirúrgica de um corte arterial de 3 cm no lado mais afetado, a peça é fixada em formol imediatamente por 24 h, dividida em cortes de 3 a 4 mm e incluída em parafina, prestando muita atenção ao alinhamento adequado do tecido no bloco, que é então armazenado em temperatura ambiente. A seleção das amostras é realizada após a verificação dos prontuários. O diagnóstico é baseado nos critérios do American College of Rheumatology 1990, que exige que os indivíduos preencham 3 de 5 domínios: idade >50 anos, nova cefaleia, sensibilidade na artéria temporal, velocidade de hemossedimentação >50 mm/hora pelo método de Westergren e TAB anormal. Por segurança, luvas de proteção devem ser usadas o tempo todo ao manusear as amostras, produtos químicos e anticorpos.
- Dos blocos embutidos, corte seções de 4-5 μm de espessura usando um micrótomo. e corar com hematoxilina e eosina (H & E). Use uma seção de controle do tecido normal selecionado para garantia de qualidade.
- Corte as secções em água morna aquecida a 40 °C para remover as rugas e retire-as com uma lâmina microscópica de vidro revestido. Coloque as lâminas de vidro numa placa quente num forno a 60 °C durante 60 minutos para facilitar a secagem e a aderência da secção à lâmina.
- Coloque as lâminas de vidro em um prato quente em um forno a 60 °C por 60 minutos para facilitar a secagem e a aderência da seção à lâmina.
- Monte 3 seções em lâminas de microscópio.
- Coloque as lâminas em uma grade vertical e seque durante a noite a 37 ° C por 24 h.
- Coloque as lâminas em um recipiente e armazene a 4 °C.
2. Preparação imuno-histoquímica, desparafinagem, recuperação e coloração de antígenos
- Carregue as lâminas em um rack de slides. Passe a grelha pelos pratos da seguinte forma: Duas vezes em xileno 100% por 5 minutos com 10 segundos de agitação suave a cada 30 segundos, uma vez em etanol 100% com 10 segundos de agitação, uma vez em etanol 90% com 10 segundos de agitação, uma vez em etanol 70% com 10 segundos de agitação e duas vezes em H2O bidestilado com 10 segundos de agitação.
nota: O manuseio de xileno e acetona deve ser feito em coifas ventiladas para evitar inalação e toxicidade respiratória.
- Recupere o antígeno transferindo o rack para um recipiente de vidro com 200 mL de tampão citrato de pH 6,0 a 10 mmol / L pré-aquecido a 95 ° C. Ajuste o temporizador para 30 minutos no banho-maria, depois deixe esfriar em temperatura ambiente por 20 minutos e depois enxágue com água corrente por 5 minutos.
- Remova a atividade da peroxidase endógena incubando em 200 mL de peróxido de hidrogênio a 3% por 10 minutos. Lave as lâminas 3 vezes em 200 μL de solução salina tamponada com Tris (TBSS).
- Remova as lâminas do rack e enxugue cada uma suavemente para limpar o excesso de buffer. Para coloração, adicione 200 μL dos seguintes anticorpos primários, adicione lamínulas nas lâminas e incube em uma câmara úmida por 1 hora em temperatura ambiente:
Anticorpo anti-receptor de folato beta (FRB) diluído 1:800
CD68 monoclonal de camundongo anti-humano, diluição 1:200
Coelho policlonal anti-CD3 diluição 1:100
nota: Seções da placenta fixadas em formalina e embebidas em parafina também foram processadas conforme descrito nas etapas 2.1 a 2.9 e incubadas com anti-FRB18 e usadas como controle positivo. Os resultados da coloração foram obtidos encontrando a concentração ideal de anticorpos e foram realizados titulando o anticorpo em diluições duplas (por exemplo, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600).
- Remova a lamínula após a incubação e descarte. Enxágue as lâminas 3 vezes por 2 minutos cada com TBSS, escorra e limpe o excesso de tampão.
- Adicione 200 μL de solução de anticorpo secundário contendo anticorpo secundário anti-coelho/camundongo biotinilado para reagir com o anticorpo primário não conjugado ligado ao antígeno tecidual. Coloque as lamínulas nas lâminas e incube em uma câmara úmida por 45 minutos em temperatura ambiente.
- Remova a lamínula após a incubação e descarte. Enxágue as lâminas 3 vezes por 2 minutos cada com TBS, escorra e limpe o excesso de tampão.
- Adicione 200 μL de diaminobenzidina (DAB) + tampão substrato (Imidazol HCl) - sistema cromógeno e incube por 10 minutos para visualizar o padrão de coloração. Lave com TBSS e depois em água corrente da torneira por 10 minutos.
- Contra-coloração com hematoxilina por 3 minutos.
- Monte as lâminas aplicando 70 μL de meio de montagem na superfície da lâmina. Incline lentamente a lamínula para o meio de montagem e evite criar bolhas ao baixá-la no lugar. Aguarde 24 horas para secar.
3. Análise histopatológica e imuno-histoquímica (IHQ)
Examine as seções coradas com H&E e IHC de indivíduos GCA-positivos e normais usando um microscópio óptico.
- Para as seções manchadas de H&E
- Avalie a arquitetura vascular e identifique células endoteliais na túnica íntima, células musculares lisas na túnica média e fibroblastos e vasa vasorum na túnica adventícia.
- Identifique as características da ACG, que incluem infiltração de linfócitos e macrófagos/histiócitos, hiperplasia celular e degradação da lâmina elástica interna.
- Analise o infiltrado linfo-histiocítico identificando e quantificando o número de macrófagos em relação aos linfócitos. Avalie a extensão da ruptura da lâmina elástica interna e das alterações hiperplásicas nas células residentes e compare-as com os controles.
- Para as seções coradas com IHC
- Examine o padrão de coloração do FRB, observando sua expressão por um tipo ou tipos específicos de células e sua distribuição nas camadas vasculares e sua relação com o infiltrado imunológico total, o marcador macrófago total, anti-CD68 e o marcador de linfócitos pan anti CD3.
- Quantifique a expressão de células FRB, CD68 e CD3 contando as células coradas positivamente em 10 campos de alta potência (hpf) selecionados aleatoriamente e registre as médias.
nota: A identificação dessas células e estruturas normais e patológicas foi realizada por um patologista cardiovascular e reumatologista certificados, e os resultados foram registrados para todos os casos.
- Capture imagens representativas usando uma câmera digital.
NOTA: Após essas etapas, as alíquotas restantes podem ser armazenadas a -80 °C.
