$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Coleta de tecidos e reticulação UV
- Eutanasiar 2 camundongos adultos usando dióxido de carbono (CO2) por 1-2 min ou até que a respiração pare. Em seguida, execute a luxação cervical em cada mouse.
- Colha cerca de 100 mg de testículos de camundongos de idade apropriada (um testículo adulto neste estudo) para cada experimento de imunoprecipitação e coloque os tecidos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada.
- Remova a túnica albugínea suavemente com uma pinça de ponta fina.
- Adicione 3 mL de PBS gelado em um moedor de lenços de papel e triture o tecido por força mecânica leve usando um pilão de vidro solto (pilão de vidro tipo A).
NOTA: O objetivo desta etapa não é lisar as células, mas separar o tecido. A preservação da viabilidade e integridade celular é importante.
- Transfira a suspensão de tecido para uma placa de cultura de células (10 cm de diâmetro) e adicione PBS gelado até 6 mL.
- Agite o prato rapidamente para que o líquido cubra o fundo do prato uniformemente. Se o tecido for moído adequadamente, túbulos seminíferos uniformemente distribuídos serão visíveis, enquanto a presença de aglomerados de tecido indica que a dispersão do tecido é abaixo do ideal.
- Reticule a suspensão três vezes com 400 mJ/cm2 a 254 nm no gelo. Misturar suspensão entre cada irradiação.
nota: Para cada novo experimento, a reticulação deve ser otimizada.
- Colete a suspensão em um tubo cônico de 15 mL e pellet a 1.200 x g por 5 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 1 mL de PBS e, em seguida, transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Gire a 4 ° C e 1.000 x g por 2 min e remova o sobrenadante.
- Neste ponto, prossiga imediatamente com o resto do protocolo ou congele os pellets em nitrogênio líquido e armazene-os a -80 °C até o uso.
2. Preparação de Contas
- Adicione 125 μL de esferas magnéticas de proteína A por amostra (pellet) a um tubo de centrífuga fresco.
nota: Use esferas magnéticas de proteína G para anticorpos de camundongo.
- Coloque o tubo no ímã para separar as esferas da solução. Após 10 s, remova o sobrenadante. Lave as esferas duas vezes com 1 mL de tampão de lise gelada.
nota: A separação subsequente dos grânulos magnéticos da proteína A segue esta etapa. A composição do tampão de lise é de 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 100 mM; 1% NP-40; 0,1% de SDS; desoxicolato de sódio a 0,5%; Coquetel inibidor de protease livre de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1/50 (adicione fresco).
- Ressuspenda os grânulos em 100 μL de tampão de lise fria com 10 μg de anticorpo eCLIP. Gire os tubos em temperatura ambiente por 45 min.
nota: A concentração final de anticorpos para imunoprecipitação é de 10 μg/mL. Se a concentração de anticorpos for desconhecida, a quantidade de anticorpos deve ser otimizada.
- Lave as contas duas vezes com 1 mL de tampão de lise gelado.
3. Lise tecidual e digestão parcial de RNA
- Ressuspenda os grânulos de tecido em 1 mL de tampão de lise fria (adicione 22 μL de coquetel de inibidor de proteína livre de 50x (EDTA) e 11 μL de inibidor de RNase a 1 mL de tampão de lise).
- Ressuspenda dois pellets reticulados UV e dois pellets não reticulados por grupo de experimentos: pellets UV-crosslinked-1 para a biblioteca eCLIP (UV-1); Pellets UV-reticulados-2 para biblioteca eCLIP (UV-2); pellets não reticulados-1 para a biblioteca eCLIP como controle (não UV); 2 pellets não reticulados para IgG IP para demonstrar a especificidade dos anticorpos.
nota: O controle ideal para a biblioteca eCLIP dos testículos largos reticulados por UV é o dos testículos knockout reticulados por UV de camundongos da mesma ninhada.
- Continue lisando as amostras no gelo por 15 min (para evitar a degradação de proteínas e RNA).
- Sonicar em um sonicador digital a 10% de amplitude por 5 min, a 30 s ligado/30 s desligado. Sempre coloque a amostra no gelo e limpe a sonda com água livre de nuclease entre cada amostra.
- Adicione 4 μL de DNase a cada tubo e misture bem. Incubar por 10 min a 37 °C, agitando a 1.200 rpm.
- Adicione 10 μL de RNase I diluída (4 U/μL RNase I em PBS) e misture bem. Incubar durante 5 min a 37 °C, agitando a 1.200 rpm.
- Limpar o lisado por centrifugação a 15.000 x g durante 20 min (a 4 °C).
- Colete cuidadosamente o sobrenadante. Deixe 50 μL de lisado e descarte o pellet com ele.
- Salve amostras de entrada como RWB (executar para western blot) e RRI (executar para isolamento de RNA). Economize 20 μL (2%) de amostras UV-1, UV-2, não UV e IgG como entradas para o carregamento do gel RWB. Economize 20 μL (2%) de amostras UV-1 ou UV-2 como entradas para o carregamento do gel RRI.
4. Imunoprecipitação
- Adicionar 1 ml do lisado (do passo 3.7) aos grânulos (preparados na secção 2) e rodar as amostras a 4 °C durante 2 h ou durante a noite.
- Colete as contas com um suporte magnético e descarte o sobrenadante. Lave os grânulos duas vezes com 900 μL de tampão com alto teor de sal (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl; 1 mM EDTA; 1% NP-40; 0,1% SDS; 0,5% de desoxicolato de sódio) e, em seguida, lave os grânulos duas vezes com 900 μL de tampão de lavagem (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl2; 0,2% Tween-20).
nota: Para a amostra de IgG, pause o procedimento aqui e guarde-o no gelo em um tampão de lavagem.