Um ensaio para análise do ciclo celular de células T CD8+ específicas do antígeno

Resumo

Fonte: Simonetti, S., et al. Um ensaio de citometria de fluxo baseado em DNA/Ki67 para análise do ciclo celular de células T CD8 específicas do antígeno em camundongos vacinados. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra um ensaio para analisar células T CD8⁺ específicas do antígeno em diferentes estágios do ciclo celular. As células viáveis marcadas com fluorescência são selecionadas usando citometria de fluxo, e as células nos diferentes estágios do ciclo celular são identificadas por seu conteúdo de DNA usando anticorpos contra a proteína nuclear associada à proliferação celular e uma coloração de ácido nucleico.

Protocolo

1. Preparação do meio e da solução de coloração

1. Prepare o meio completo: meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) com 2 mM de glutamina, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 50 μM de beta-mercaptoetanol e 10% de volume/volume (v/v) de soro fetal bovino (FBS)
2. Prepare o tampão de coloração: solução salina tamponada com fosfato sem Ca²⁺/Mg²⁺ (PBS) com 1% de peso/volume (p/v) de albumina de soro bovino (BSA) e sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 2 mM

2. Tratamento de camundongos

1. Prime camundongos Balb / c fêmeas de 7 a 8 semanas de idade por injeção intramuscular (i.m.) no quadríceps do vetor adenoviral do vírus da imunodeficiência humana (HIV) -1-gag-expressando-chimpanzé (ChAd3-gag) com uma dose de 10⁷ partículas virais.
2. De 1 a 4 meses após o priming, aumente uma vez os camundongos por injeção intravenosa de vírus vaccinia Ankara modificado que expressa HIV-1-gag (MVA-gag) com uma dose de 10⁶ unidades formadoras de placas.
3. No dia 3 pós-reforço, sacrifique os camundongos impulsionados por luxação cervical e analise-os em paralelo com camundongos não tratados.
4. Colha os gânglios linfáticos (LNs) que drenam o quadríceps (ilíaco, poplíteo e inguinal) e os baços de camundongos reforçados e não tratados. Além disso, colete a medula óssea (MO) das duas patas traseiras de camundongos não tratados e use esta MO para configurações de citômetro de fluxo e como controle positivo para análise do ciclo celular (Figura 1).
   nota: Gere os vetores ChAd3-gag e MVA-gag conforme descrito anteriormente.

3. Isolamento de LN drenante, baço

1. Isolamento de células do baço e LN
   1. Coloque 5 mL de meio completo em cada um dos dois tubos de 15 mL e mantenha-os no gelo, prontos para a coleta dos órgãos.
   2. Sacrifique um camundongo adulto por luxação cervical.
   3. Coloque o camundongo de costas e esterilize a superfície da pele com etanol a 70% v / v.
   4. Para coletar LNs inguinais, faça uma incisão longitudinal de ~ 1 cm no abdômen com uma tesoura e estique a incisão com a pinça.
   5. Visualize os LNs inguinais na superfície interna da pele e colete-os com a pinça. Coloque os LNs inguinais em um dos dois tubos de 15 mL preparados na etapa 3.1.1.
   6. Para coletar o baço, faça uma incisão peritoneal com uma tesoura e remova o baço. Depois de cortar o tecido conjuntivo circundante, coloque o baço no segundo tubo de 15 mL preparado na etapa 3.1.1.
   7. Para coletar LNs ilíacos, mova os intestinos para o lado e visualize os LNs ilíacos próximos à veia cava inferior e, em seguida, colete-os usando a pinça. Colocar os LNs ilíacos no mesmo tubo que contém os LNs inguinais.
      nota: Para obter células LN suficientes para coloração (consulte a seção 4), geralmente é necessário agrupar LNs poplíteos, inguinais e ilíacos de um camundongo. Todos esses LNs estão drenando o quadríceps (o local da vacinação intravenosa). Este protocolo usa apenas um tubo de 15 mL de LNs agrupados.
   8. Para coletar LNs poplíteos, segure a pele das patas traseiras e puxe-a suavemente para baixo para descobrir os músculos. Em seguida, insira a pinça entre os músculos sob a articulação do joelho e colete os LNs poplíteos. Coloque os LNs poplíteos no mesmo tubo contendo LNs inguinais e ilíacos.
      nota: Ver nota após o ponto 3.1.7.
   9. Coloque o baço em um filtro de células de 70 μm dentro de uma placa de cultura de 60 mm cheia de 5 mL de meio completo. Usando um êmbolo de seringa de 5 mL, amasse suavemente o órgão até sua completa desagregação.
   10. Remova o filtro e transfira a suspensão celular para um tubo limpo de 15 mL.
   11. Adicione 5 mL de meio completo à placa de cultura e lave cuidadosamente a placa e a peneira para garantir que todas as células foram recuperadas. Junte com o resto da suspensão das células do baço no tubo de 15 mL.
   12. Para os LNs inguinais, ilíacos e poplíteos agrupados, prepare uma suspensão unicelular seguindo um procedimento semelhante ao usado nas etapas 3.1.9 a 3.1.11 para o baço.
   13. Centrifugar as células a 400 × g durante 10 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender os sedimentos em PBS.
   14. Conte as células com uma câmara de Neubauer usando tampão de lise de glóbulos vermelhos e 0,04% v / v de azul de tripano em PBS.

4. Coloração do baço, LN

1. Divida as amostras de células a serem coradas em 3 subgrupos: amostras de células para compensação, incluindo células BM de camundongos não tratados a serem coradas apenas com Hoechst 33342 (doravante denominadas Hoechst) e células do baço de camundongos não tratados a serem usadas para preparar uma mistura de células mortas/vivas para compensação de corante de células mortas; controle positivo para análise do ciclo celular, consistindo em uma amostra de MO de camundongos não tratados; e amostras experimentais contendo amostras de baço e NL de camundongos não tratados e vacinados.
   nota: Certifique-se de que haja baço e células LN suficientes para análise de um número suficiente de células T CD8 específicas para gag. Muitas vezes é necessário usar células do baço agrupadas e células LN agrupadas de 3 camundongos vacinados e corar duas ou mais amostras idênticas de células agrupadas, cada uma contendo 3 × 10⁶ células. Mesclar amostras idênticas na etapa de coloração de Hoechst. Da mesma forma, coifique células do baço e células LN de 3 camundongos não tratados e mescle amostras idênticas no final. Separe uma amostra não corada de células do baço de um camundongo não tratado para ser usada para o instrumento e a configuração de compensação.
2. Prepare a mistura de células mortas/vivas para compensação do corante de células mortas (esta mistura de células será corada apenas com o corante de células mortas).
   1. Aquecer um banho-maria a 65 °C.
   2. Pegue uma alíquota de células do baço (~ 3 × 10⁶).
   3. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga, coloque-a no banho-maria a 65 °C por 5 min e, em seguida, coloque-a imediatamente no gelo por 10 min.
   4. Misture as células mortas pelo calor com células vivas do baço (~ 3 × 10⁶) na proporção de 1: 1 e transfira metade da mistura para uma placa inferior de 96 poços redondos (~ 3 × 10⁶ células / poço para o controle de coloração de células mortas).
3. Coloração de células mortas de amostras experimentais, controle positivo para análise do ciclo celular e mistura de células mortas/vivas
   1. Transferir o baço, a NL, as células BM (3 × 10⁶ células/alvéolo) e a mistura de células mortas/vivas (secção 4.2) para uma placa de fundo redondo de 96 poços, de acordo com o esquema de coloração (passo 4.1), e centrifugar a 400 × g durante 3 min a 4 °C.
   2. Ressuspenda cada pellet celular em 50 μL de corante de células mortas diluído em PBS e ressuspenda pipetando para cima e para baixo 3 vezes imediatamente.
   3. Incubar durante 30 min a 4 °C, protegido da luz.
   4. Lave as células 2 vezes com tampão de coloração; a primeira vez com 200 μL e a segunda vez com 250 μL. Para cada lavagem, centrifugue a placa a 400 × g durante 3 min a 4 °C.
   5. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 20 μL de PBS.
4. Coloração de células de membrana com multímeros peptídicos do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e anticorpos monoclonais (mAbs).
   1. Tendo em conta os volumes necessários de acordo com o esquema de coloração (configurações do citómetro de fluxo, quadro 1), preparar os seguintes reagentes:
      1. Diluir o mAb 2.4G2 no tampão de coloração de acordo com a diluição apropriada (ver Tabela de Materiais); para cada amostra a ser corada, use 10 μL desta diluição.
         NOTA: O mAb 2.4G2 bloqueia a ligação não específica do antígeno de imunoglobulinas aos receptores FcγIII e FcγII.
      2. Diluir o tetrâmero (Tetr-gag) marcado com aloficocianina (APC) H-2k(d) no tampão de coloração para obter a diluição apropriada (ver Tabela de Materiais); para cada amostra a ser corada, use 20 μL desta diluição.
      3. Preparar a mistura de anticorpos diluindo os mAbs no tampão de coloração de acordo com a diluição apropriada (ver Tabela de Materiais) que foi previamente determinada em experiências de titulação; para cada amostra a ser corada, utilizar 20 μL desta mistura de anticorpos.
         nota: Aqui, a proteína clorofila peridinina anti-CD3e (PerCP-Cy5.5) (clone 145-2C11), ultravioleta brilhante anti-CD8a (BUV805) (clone 53-6.7) e anti-CD62L ficoeritrina cianina7 (PECy7) (clone MEL-14) foram usados.
   2. Adicione 10 μL do 2.4G2 mAb previamente diluído (etapa 4.4.1.1) e incube por 10 min a 4 °C, protegido da luz.
   3. Adicione 20 μL do APC Tetr-gag previamente diluído (etapa 4.4.1.2) e 10 μL de pentâmero de ficoeritrina (PE) H-2k (d) AMQMLKETI ( Incubar durante 15 min a 4 °C, protegido da luz.
   4. Adicione 20 μL da mistura de anticorpos previamente preparada (etapa 4.4.1.3) e incube por 15 min a 4 °C, protegida da luz.
      nota: Portanto, o volume final é de 80 μL por poço (etapa 4.3.5, etapas 4.4.2 a 4.4.4).
   5. Lave as células com 200 μL de tampão de coloração. Centrifugue a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
   6. Ressuspenda o pellet celular em 250 μL de tampão de coloração e transfira a suspensão celular para tubos de 5 mL. Adicione 1 ml de tampão de coloração ao tubo e centrifugue a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
   7. Tomar a alíquota de células BM (3 × 10⁶ células) (ver lista de amostras de células, secção 4.1) a utilizar para compensar o canal de Hoechst (Hoechst 33342 é excitado por um laser ultravioleta (definições do citómetro de fluxo (quadro 2)) e transferir a suspensão celular para um tubo de 5 ml. Adicione 1 ml de tampão de coloração ao tubo e centrifugue 400 × g durante 5 min a 4 °C.

5. Fixação/permeabilização

1. Prepare um novo tampão de fixação/permeabilização diluindo 1 parte do concentrado de fixação/permeabilização com 3 partes de diluente de fixação/permeabilização, de acordo com as instruções do fabricante.
2. Descarte o sobrenadante e pulse o vórtice das amostras para desagregar completamente o pellet.
3. Adicione 1 mL do tampão de fixação/permeabilização recém-preparado a cada tubo, incluindo um tubo com células do baço não coradas (3 x 10⁶, consulte a lista de amostras de células, seção 4.1) e vórtice.
4. Incubar por 16 h a 4 °C.
   nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

6. Coloração intracelular

1. Coloração Ki67
   1. Prepare o tampão de permeabilização fresco 1x diluindo o tampão de permeabilização 10x com água destilada, de acordo com as instruções do fabricante. Antes do uso, o tampão de permeabilização 1x deve ser filtrado através de um filtro de 0,45 μm para eliminar agregados.
   2. Diluir o isotiocianato de fluoresceína mAb Ki67 (FITC) (clone SolA15) em tampão de permeabilização 1x (ver Tabela de Materiais), conforme determinado anteriormente em experimentos de titulação (volume final de 100 μL por amostra).
   3. Adicione 3 mL de tampão de permeabilização 1x a cada tubo e centrifugue a 400 × g por 5 min em temperatura ambiente (RT).
   4. Rejeitar o sobrenadante e repetir o passo 6.1.3.
   5. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 100 μL de mAb Ki67 FITC previamente diluído (passo 6.1.2).
   6. Incubar por 30 min em RT, protegido da luz.
   7. Lave as células 2 vezes com 4 mL de tampão de permeabilização 1x. Para cada lavagem, centrifugue a 400 × g por 5 min em RT.
   8. Ressuspender o sedimento celular em PBS tendo em conta os seguintes volumes: 350 μl de PBS para as amostras a adquirir directamente no citómetro de fluxo; 250 μl de PBS para as amostras a incubar com Hoechst pouco antes da citometria de fluxo (ponto 6.2).
2. Coloração de DNA
   1. Adicionar 250 μL de 4 μg/ml de Hoechst em PBS a cada amostra (a concentração final de Hoechst é de 2 μg/ml).
      NOTA: No caso de duas ou mais amostras idênticas de 250 μL em PBS terem sido preparadas, mescle-as nesta etapa e adicione um volume igual de 4 μg / mL de solução de Hoechst em PBS (a concentração final de Hoechst é de 2 μg / mL). O número de células influencia muito a etapa de coloração do DNA. Use o mesmo número de célula em cada amostra. Esteja ciente de que mesmo um número de células ligeiramente reduzido (por exemplo, devido à perda de células em etapas de lavagem anteriores) resulta em maior ligação de Hoechst ao DNA e maior intensidade de Hoechst.
   2. Incubar durante 15 min em RT, protegido da luz.
   3. Centrifugar as amostras a 400 × g durante 5 min à RT.
   4. Ressuspenda o pellet celular em 350 μL de PBS.

7. Preparação de amostras de contas de compensação

1. Prepare 5 μL do anticorpo diluindo o mAb no tampão de coloração adequadamente.
   nota: Para cada mAb conjugado com fluorocromo usado no experimento, prepare sua amostra de cordão de compensação correspondente.
2. Controle Negativo de Vórtice e Anti-Rato/Hamster Ig,κ Comp Beads antes do uso.
3. Para cada amostra, introduza uma gota (~ 20 μL) de CompBeads de controle negativo e uma gota de CompBeads anti-rato / hamster Ig,k.
4. Adicione 5 μL do anticorpo pré-diluído (etapa 7.1) ao tubo e pipete para cima e para baixo.
5. Incubar durante 15 min a 4 °C, protegido da luz.
6. Lave as amostras com 2 mL de tampão de coloração. Centrifugue a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
7. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento adicionando 500 μL de PBS a cada tubo e vórtice.

8. Configuração do instrumento e da compensação e aquisição experimental da amostra no citómetro de fluxo

NOTA: Consulte as configurações do citômetro de fluxo (Tabela 2) para a configuração do citômetro.

1. Configuração geral de instrumentos e remuneração
   1. Abra o software para aquisição de amostra (consulte Tabela de Materiais) e crie um novo experimento clicando em Novo Experimento na seção da faixa de opções do espaço de trabalho e selecionando Novo Experimento em Branco.
   2. Clique duas vezes no experimento criado para abri-lo.
   3. Na janela Configurações do citômetro, clique em Parâmetros e selecione todos os canais (por exemplo, PE, APC, etc.) usados no painel de coloração, incluindo os parâmetros Forward Scatter (FSC) e Side Scatter (SSC).
   4. Selecione a escala linear como um parâmetro Hoechst desmarcando a escala logarítmica e verifique a Largura (W) do pulso de tensão para FCS, SSC e Hoechst.
      nota: Todos os parâmetros são mostrados por padrão em escala logarítmica (log), exceto FSC e SSC que estão em escala linear. Todos os parâmetros são analisados pela Área (A) e pela Altura (H) do pulso de tensão.
   5. Na Planilha Global, crie um gráfico de pontos com FSC-A no eixo x e SSC-A no eixo y.
   6. Execute a amostra de baço não corado clicando em Adquirir Dados no Painel de Aquisição.
   7. Defina as configurações apropriadas de FSC e SSC para visualizar as células modificando os valores de tensão na seção Parâmetros e crie uma porta para selecionar todas as células exibidas no gráfico de pontos FSC-A/SSC-A clicando em Porta de Polígono na barra de ferramentas da área de trabalho da Planilha Global.
   8. Exiba as células fechadas em histogramas com cada parâmetro de fluorescência no eixo x.
   9. Execute amostras de baço não coradas e totalmente coradas para ajustar o detector de fluorescência (PMT) para ter uma separação clara entre sinais negativos e positivos das células coradas para cada parâmetro de fluorescência.
   10. Para executar a configuração de compensação, clique em Experimento na faixa de opções do espaço de trabalho e, na seção Configuração de Compensação, selecione Criar Controles de Compensação. Desmarque Incluir tubo/poço de controle não manchado e clique em OK.
       nota: Esta operação resultará na criação de um espécime denominado Controles de Compensação e uma Planilha Normal contendo várias planilhas correspondentes a cada parâmetro selecionado.
   11. Execute um sample de contas de compensação (consulte a seção 6); defina as configurações FSC e SSC apropriadas para visualizar as contas modificando os valores de tensão e o limite de aquisição de 5.000 nos parâmetros FSC na janela do citômetro.
   12. Ajuste a porta P1 na população de contas e verifique se os picos positivo e negativo são visíveis no eixo x. Repita essa operação para cada amostra de conta de compensação e, por fim, registre cada arquivo de amostra clicando em Registrar Dados no Painel de Aquisição (registre pelo menos 5.000 eventos para cada amostra).
   13. Para cada amostra de esferas registrada, defina as portas P2 e P3 nos picos positivo e negativo, respectivamente.
   14. Execute as amostras de células para compensação (consulte as etapas 4.2 e 4.4.7 e as seções 5 e 6). Modifique as tensões FSC e SSC e o valor limite para visualizar as células, ajustar a porta P1 e, finalmente, registrar cada arquivo de amostra (registre pelo menos 10.000 eventos). Defina as portas P2 e P3 nos picos positivo e negativo, respectivamente.
       nota: Para a compensação do canal Hoechst, use o G₀/G₁ como pico negativo (P3) e o G₂/M como o pico positivo (P2).
   15. Clique em Experimento na seção da faixa de opções do espaço de trabalho e, na seção Configuração de Compensação, selecione Calcular Compensação.
   16. Nomeie a configuração de compensação criada, vincule e salve-a no experimento atual.
2. Aquisição experimental de amostras
   1. Abra um espécime clicando em Novo Espécime na barra de ferramentas do navegador e crie a estratégia de passagem na Planilha Global.
      nota: A estratégia de gating de aquisição de amostra é semelhante à da análise de amostra, descrita na Figura 2 e na Seção 9.
   2. Exibir todas as populações de eventos em um histograma com CD3-A no eixo x. Crie uma porta de intervalo para selecionar apenas as células CD3⁺.
   3. No Painel de aquisição, selecione a porta de armazenamento como Todos os eventos para amostras LN e Todas as células Eventos ou CD3⁺ para amostras de baço.
   4. Execute as amostras experimentais em baixa velocidade e, finalmente, registre todos os arquivos, certificando-se de coletar pelo menos 100-200 células T CD8 específicas do antígeno para cada amostra dos camundongos vacinados.
      nota: O tamanho do arquivo das amostras experimentais geralmente é grande (30-120 MB), especialmente quando a frequência de células T CD8 específicas do antígeno é baixa. Portanto, um grande número de eventos (> 1 × 10⁶) deve ser coletado para registrar pelo menos 100-200 células T CD8 específicas do antígeno. Arquivos grandes podem retardar o processo de análise de dados subsequente. A aquisição de apenas células CD3⁺ em amostras de baço (consulte a etapa 8.2.2 acima) é útil para manter o tamanho do arquivo menor.
   5. Execute e registre o controle positivo para análise do ciclo celular, ou seja, amostra de MO de camundongos não tratados.

9. Análise dos dados

1. Abra o software (consulte Tabela de Materiais) e crie diferentes grupos correspondentes aos diferentes órgãos a serem analisados clicando em Criar Grupo na seção da faixa de opções da área de trabalho (ou seja, crie o grupo "a-LNs"; "b-baço"; "c-BM").
   nota: Os grupos recém-criados aparecerão na lista de grupos, enquanto o grupo "Compensação" é gerado automaticamente pelo software.
2. Abra a janela Modificar grupo clicando duas vezes no nome do grupo e verifique se os grupos recém-criados estão sincronizados. Caso contrário, insira uma marca de seleção na função Sincronizado.
3. Arraste cada arquivo .fcs em seu grupo correspondente.
4. Crie a estratégia de passagem começando com o grupo "a-LNs".
5. Clique duas vezes na amostra totalmente corada no grupo para abrir a janela do gráfico; os eixos x e y são rotulados como nos arquivos fcs (consulte as configurações do citômetro de fluxo, Tabela 2).
6. Exiba o total de eventos adquiridos para esta amostra em um gráfico de pontos com DNA-A no eixo x e DNA-W no eixo y.
7. Selecione apenas a população de célula única clicando em Retângulo na seção de ferramentas de gating da janela do gráfico.
   nota: As células individuais têm valores de DNA-A da seguinte forma: 2N (baixo): entre 2N e 4N (intermediário), ou igual a 4N (alto), enquanto os valores de DNA-W são idênticos para todas elas (etapa 1 da Figura 2).
8. Clique duas vezes no centro da porta retangular para exibir células individuais em um gráfico de pontos com o parâmetro FSC-A no eixo x e corante de célula morta no eixo y.
9. Selecione apenas a população de células ativas clicando em Polígono na seção de ferramentas de gating da janela do gráfico. As células vivas são negativas para o corante de células mortas (etapa 2 da Figura 2).
10. Clique duas vezes no centro da porta poligonal para exibir as células em um gráfico de pontos com o parâmetro FSC-A no eixo x e o parâmetro SSC-A no eixo y.
11. Clique em Retângulo e crie uma porta "relaxada" para incluir todas as células ativas individuais nesse gráfico (etapa 3 da Figura 2).
12. Clique duas vezes no centro da porta "relaxada" para exibir as células em um gráfico de pontos com CD3 no eixo x e CD8 no eixo y.
13. Selecione as células CD3⁺CD8⁺ clicando em Polígono (etapa 4 da Figura 2).
14. Clique duas vezes no centro da porta CD3⁺CD8⁺ para exibir as células em um gráfico de pontos com Tetr-gag no eixo x e Pent-gag no eixo y.
15. Selecione as células T CD8 específicas do antígeno (positivas para Tetr-gag e Pent-gag) clicando em Polígono (etapa 5 da Figura 2).
16. Clique duas vezes no centro da porta específica da gaga para exibir as células em um gráfico de pontos com DNA-A no eixo x e Ki67 no eixo y (Figura 3).
17. Selecione as células nas diferentes fases do ciclo celular clicando em Quad na seção da ferramenta de gating da janela do gráfico.
    nota: As células na fase G₀ são células baixas do DNA Ki67neg (quadrante inferior esquerdo); as células em G₁ são Ki67pos-DNA baixo (quadrante superior esquerdo); as células em S-G2 / M são intermediárias / altas de Ki67pos-DNA (quadrante superior direito) (Figura 3).
18. Copie a estratégia de passagem criada em uma amostra para o grupo correspondente para aplicar as portas a todas as amostras do grupo.
19. Repita as etapas 9.5 a 9.18 para o "grupo a-LN".
20. Verifique se todas as portas são apropriadas para cada amostra do grupo "b-baço". Para analisar o ciclo celular entre as células BM (controle positivo), clique no centro da porta "relaxada" para exibir as células em um gráfico de pontos com DNA-A no eixo x e Ki67 no eixo y.
21. Verifique se todas as comportas são apropriadas para cada amostra dos 3 grupos (ou seja, para células do baço, LN e BM).
    nota: O portão de população de célula única (etapa 9.7) e o Quad gate para o ciclo celular (etapa 9.17) podem ter coordenadas de portão diferentes em amostras diferentes, principalmente devido às possíveis pequenas diferenças na intensidade do corante Hoechst entre as amostras (seção 6.2). Por esse motivo, pode ser necessário modificar o portão de população de célula única e o Quad Isso será feito da seguinte maneira: clique duas vezes no nome do grupo e remova a sincronização das propriedades do grupo. Esta operação permite a modificação das portas em uma amostra sem modificar as mesmas portas em todas as outras amostras do grupo. Após a remoção da sincronização, modifique os portões quando necessário.
22. Para visualizar os resultados obtidos por esta análise, clique em Editor de Layout na seção da faixa de opções da área de trabalho para abri-lo. Arraste cada portão da estratégia de passagem no painel de amostra para o editor de layout e coloque as plotagens de acordo com a sequência da estratégia de passagem de canal. Se necessário, altere o tipo de gráfico clicando duas vezes no gráfico correspondente no layout e selecionando o Tipo apropriado na janela Definição de gráfico.
23. Clique nas funções Agrupar e iterar por na faixa de opções de layout para visualizar os resultados obtidos em cada órgão e comparar diferentes amostras.

Tabela 1: Configurações do citômetro de fluxo.

amostra	Painel de anticorpos
Totalmente manchado	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5	Tetr-gag APC	FVD eFluor 780	Hoechst 33342	CD8 BUV805	PE Pent-gag
Ki67 FMO		CD3 PercpCy5.5	Tetr-gag APC	FVD eFluor 780	Hoechst 33342	CD8 BUV805	PE Pent-gag
Tetr-gag APC FMO	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5		FVD eFluor 780	Hoechst 33342	CD8 BUV805	PE Pent-gag
Pent-gag PE FMO	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5	Tetr-gag APC	FVD eFluor 780	Hoechst 33342	CD8 BUV805
CD8 FMO	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5	Tetr-gag APC	FVD eFluor 780	Hoechst 33342		PE Pent-gag
CD3 FMO	Ki67 FITC		Tetr-gag APC	FVD eFluor 780	Hoechst 33342	CD8 BUV805	PE Pent-gag
Corante de viabilidade fixável FMO	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5	Tetr-gag APC		Hoechst 33342	CD8 BUV805	PE Pent-gag
Hoechst 33342 FMO	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5	Tetr-gag APC	FVD eFluor 780		CD8 BUV805	PE Pent-gag

Tabela 2: Configurações do citômetro de fluxo.

instrumento	BD LSR Fortessa
laser	Azul 488nm		Vermelho 639nm		UV 355nm		Amarelo/verde 561nm
Filtros passa-banda	530/30	710/50	Nº 670/14	780/60	530/30	820/60	Rolamento 585/15	780/60
Filtros Longpass	505LP	685LP		750LP	505LP	770LP		750LP
Fluorocromos/corantes usados	FITC	PERCPCY5.5	Apc	eFluor 780	Hoechst 33342	BUV805	Pe	PECY7
Nome correspondente em arquivos fcs	Alexa Fluor 488	PERCPCY5.5	Apc	APC-H7	Hoechst-Red	BUV737	Pe	PECY7

Resultados

Figura 1: Análise do ciclo celular das células BM. As células BM de camundongos Balb/c não tratados foram coradas e analisadas por citometria de fluxo. (A) Exemplo de estratégia de gating. Fechamos células únicas no gráfico DNA-A / -W (esquerda) e, posteriormente, em células vivas por exclusão de corante de células mortas (meio). Em seguida, uma porta FSC-A/SSC-A "relaxada" foi usada para todas as cé...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pontas de pipeta embaladas a granel de ajuste universal de 1-200 μL	Corning	CLS4866-1000EA
2.4G2 mAb anti-FcγR	Bd	553141	Concentração final de 10 μg/ml
Êmbolo de seringa de 5 ml	BD Esmeralda	307733
Tubos cônicos de 15 ml	MercK Millipore	SBHA025SB
Placa de cultura de células tratada com TC de 60 mm	falcão	353002
Filtro de células de 70 μm	falcão	352097
Microplaca de cultura tratada com TC de fundo redondo transparente de 96 poços	falcão	353077
Anti-Rato/Hamster Ig,k/Partículas de Compensação de Controle Negativo	BD- Biociência	552845
Beta-mercaptoetanol	sigma	M3148
Albumina de soro bovino	sigma	Rolamento A07030
BUV805 Rato Anti-Rato CD8a	BD- Biociência	Rolamento 564920	Concentração final de 4 μg/ml
Tampão de fosfato salino de Dulbecco sem cálcio sem magnésio	Euroclone	ECB4004L
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 mL	Eppendorf	30120159
etanol	sigma	34852-1L-M
Solução de sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	sigma	E7889
Soro fetal bovino	Corning	35-079-CV
Filcon, estéril, tipo seringa 70 μm	falcão	Rolamento 352350
Corante de viabilidade fixável eFluor 780	eBiociência	Telefone: 65-0865-14	Concentração final 1:1000
Foxp3 / Conjunto de tampão de coloração de fator de transcrição	eBiociência	00-5523-00	Este conjunto contém concentrado e diluente de fixação/permeabilização e tampão de permeabilização 10x
Tetrâmero marcado com aloficocianina (APC) H-2k(d) AMQMLKETI	fornecido pelo NIH Tetramer Core Facility		Concentração final de 6 μg/ml
H-2k(d) AMQMLKETI ficoeritrina (PE) marcada com pentâmero	Pró-imune	F176-2A-E - 176	10 μL / amostra
Hoechst 33342, Tricloridrato, Trihidrato - 10 mg / mL Solução em Água	ThermoFisher	H3570
Anticorpo monoclonal Ki-67 (SolA15), FITC	eBiociência	11-5698-82	Concentração final de 5 μg/ml
L-Glutamina 100X (200 mM)	Euroclone	ECB3000D
Filtros Millex-HA 0,45 μm	Bd	340606
Penicilina/Estreptomicina 100X	Euroclone	ECB3001D
Anticorpo anti-camundongo CD62L PE/Cyanine7	Biolenda	104418	Concentração final de 0,2 μg/ml
PerCP-Cy™5.5 Hamster Anti-Rato CD3e	BD- Biociência	551163	Concentração final de 4,4 μg/ml
Tampão de lise de glóbulos vermelhos	sigma	R7757
Tubos de poliestireno de fundo redondo, 5 mL	falcão	352058
RPMI 1640 Meio sem L-Glutamina com Vermelho de Fenol	Euroclone	ECB9006L
Pacote de software para análise de dados de citometria de fluxo	FlowJo	v.10
Software para aquisição de amostras em citômetro de fluxo	BD FACSDiva	v 6.2
Solução Trypan Blue	Euroclone	ECM0990D