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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de materiais para injeção
- Esterilize uma agulha e seringa de 33 G: desmonte e autoclave a 115 οC. Prepare as agulhas para injeção subindo em solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS).
- Descongelar as partículas marcadas com fluorescência à temperatura ambiente durante 5 a 10 min. Preparar a solução de partículas para injecção, reconstituindo-a numa solução de 50 mg/ml em PBS estéril com iões cálcio e iões magnésio (Ca2+/Mg2+).
nota: Partículas de origem fúngica marcadas com AF488 que foram validadas para ensaios de fagocitose são usadas neste protocolo. Para uma absorção ideal, prepare as partículas frescas e imediatamente antes da injeção.
NOTA 2: As concentrações de partículas podem ser otimizadas para cada experimento específico.
2. Injeção intravítrea de solução de esferas
NOTA: São necessárias duas pessoas para realizar a injeção, de forma que a pessoa que realiza a injeção possa segurar o mouse e manter o foco no globo ocular, enquanto a outra pessoa passa a seringa carregada e empurra o êmbolo.
- Anestesiar o roedor por injeção intraperitoneal de 100 mg/ml de cetamina e 10 mg/ml de xilazina na dose de 20 μl/10 g de peso corporal. Antes da injeção, use uma pinça para avaliar o nível de anestesia.
nota: O isoflurano tem um efeito profundo na função das células mieloides, portanto, seu uso ao longo deste ensaio deve ser evitado.
- Carregue a agulha com 0,5 μl de solução de partículas marcadas com fluorescência.
- Coloque o mouse de lado sob um microscópio cirúrgico (Figura 1A-B). Use um material macio, por exemplo, um pacote de gel, para melhor posicionamento do mouse. Para camundongos jovens em que os olhos ainda não estão abertos, abra suavemente as pálpebras com a ajuda de uma pinça fina de 45o angulados, criando uma fissura ao longo da fenda a partir da qual as pálpebras eventualmente se abrirão.
- Com a ajuda de uma pinça fina de 45o angular, aplique cuidadosamente a pressão ao redor da pálpebra, de modo que o globo ocular saia ligeiramente da órbita. Segure a cabeça com dois dedos logo acima da orelha e pela mandíbula e estique suavemente a pele paralelamente às pálpebras para manter o olho ligeiramente fora da órbita. Tenha cuidado para não agarrar muito perto da garganta (Figura 1B).
- Para perfurar o globo ocular, insira a agulha da seringa no limbo da córnea (onde a córnea e a esclera se conectam). Isso é visível como um círculo cinza em camundongos pigmentados. Retraia ligeiramente a agulha para expelir um pequeno volume de fluido vítreo e depois injete. A pessoa que realiza a injeção deve segurar suavemente o mouse com uma mão e a agulha com a outra; A segunda pessoa deve empurrar lentamente o êmbolo.
- Retraia a seringa lentamente. Aplique gotas hidratantes para os olhos para manter os olhos hidratados.
- Deixe o roedor se recuperar em uma gaiola sobre uma almofada térmica e continue monitorando o animal. Se estiver trabalhando com filhotes, não devolva o animal a uma gaiola com outros animais alertas até que ele esteja respirando e seja capaz de movimentos espontâneos. Se estiver trabalhando com adultos, não devolva o roedor a uma gaiola com outros animais alertas até que ele recupere a decúbito esternal.
3. Colheita de tecido retiniano
NOTA: O tecido retiniano dos olhos não injetados com partículas marcadas com fluorescência deve ser coletado como controle para análise de citometria de fluxo. Embora o ensaio possa ser realizado usando uma única retina, para melhor desempenho, duas retinas devem ser agrupadas.
- Colete o tecido retiniano 3 horas após a injeção intravítrea de partículas marcadas com fluorescência.
nota: Embora o tempo após a injeção da solução de partículas possa ser otimizado para cada experimento específico, descobrimos que 3 horas após a injeção, a absorção de partículas pode ser vista na maioria das camadas da retina ( Figura 1C-D ).
- Sacrifique camundongos por luxação cervical.
- Colete os globos oculares pressionando suavemente contra a pálpebra com a ajuda de uma pinça fina de 45o angulada para proptose o globo ocular. Posicione a pinça atrás do globo ocular e puxe.
- Dissecar a retina sob um microscópio de dissecação. Transfira o globo ocular para uma placa de Petri contendo uma pequena quantidade de PBS com Ca2+/Mg2+. Em uma área seca da placa de Petri, perfure o globo ocular no limbo da córnea com a ponta de uma pinça superfina.
- Segure o globo ocular com a ajuda de uma pinça fina de 45º angular e use uma tesoura de mola para cortar ao redor do limbo da córnea, até que cerca de metade da circunferência do limbo da córnea seja cortada.
- Segure o globo ocular com a pinça angular fina de 45º e traga o globo ocular para PBS. Com um segundo par de pinças finas de45º angulares, separe a córnea e a esclera. A lente e a retina sairão intactas.
- Separe a lente e a retina. Colete a retina e transfira-a para um tubo de ensaio de poliestireno de 5,4 ml contendo 2 ml de PBS com Ca2+/Mg2+.
4. Preparando uma suspensão de célula única
- Prepare suspensões de células únicas usando um kit de dissociação do tecido neuronal com pequenas modificações nas instruções do fabricante. Resumidamente, triturar retinas pipetando para cima e para baixo com uma pipeta P1000 e realizando uma digestão enzimática a 37 oC sem agitação.
5. Coloração de suspensões de células únicas para análise de citometria de fluxo
- Ressuspenda as células em 200 μl de tampão de coloração (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco com 0,2% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,09% de azida sódica) e transfira para uma placa de 96 poços com fundo em U. Centrifugue por 5 min a 130 x g.
nota: A azida de sódio é prejudicial aos seres humanos e ao meio ambiente. Use equipamento de proteção individual adequado e descarte os resíduos de acordo com os regulamentos locais.
- Inverta o prato sobre uma pia para descartar o sobrenadante. Para bloquear os receptores Fc, ressuspenda as células em 25 μl de tampão de coloração contendo 5 μg / ml de anticorpo anti-camundongo CD16 / CD32 por poço. Incube por 5 min em temperatura ambiente.
- Adicione 25 μl de tampão de coloração contendo 0,5 μg/ml de anti-camundongo Ly6C-APC-Cy7, 0,5 μg/ml de anti-camundongo Ly6G-Pe-Cy7 e 2,5 μg/ml de anti-camundongo CD11b-BV650. Incube por 15 min em temperatura ambiente no escuro.
- Centrifugue por 5 min a 130 x g. Inverta a placa para descartar o sobrenadante. Lave ressuspendendo as células em 200 μl de tampão de coloração.
- Centrifugue durante 5 min a 130 x g. Ressuspenda em 200 μl de tampão corante contendo 0,5 μg/ml de iodeto de propídio (PI). Transferir para tubos de microtitulação de 1,2 ml.
- Lave os poços com 100 μl adicionais de tampão de coloração contendo 0,5 μg/ml de PI e pool com os 200 μl anteriores nos tubos de microtitulação de 1,2 ml. Obtém-se um volume total de 300 μl de células coradas.
6. Análise de citometria de fluxo
- Usando um laser convencional de três (violeta, azul e vermelho), evite corantes PE, PerCP-Cy5.5, BV510 e PI devido ao transbordamento significativo das partículas fluorescentes AF488 extremamente brilhantes. Use um quarto laser (amarelo) para otimizar este ensaio, pois permite o uso de anticorpos marcados com PE e PI (no canal mCherry em vez do canal PerCP-Cy5.5) (Figura 2).
nota: Se um laser amarelo não estiver disponível, use um corante de exclusão de células mortas em outro canal.
- Gate em células PI negativas (PI-) para excluir células mortas (Figura 2B).
- Depois de excluir as células mortas, gate nas células CD11b positivas (CD11b +), isso incluirá todas as células mieloides ( Figura 2C ).
- Dentro da população CD11b+, gate em Ly6C-/Ly6G- para excluir neutrófilos (CD11b+/Ly6G+) e monócitos (CD11b+/Ly6C+; Figura 2D). Após o bloqueio da micróglia (aqui definida como CD11b + / Ly6C- / Ly6G- para simplificar), duas populações claras devem ser visíveis; um negativo e um positivo para as partículas marcadas com fluorescência. As células fagocíticas terão absorvido partículas e são, portanto, AF488+ (Figura 2E).
nota: Populações positivas para Ly6C ou positivas para Ly6G também podem ser analisadas para medir a absorção de partículas usando essa abordagem de coloração. A porcentagem de células CD11b+ fagocíticas se correlaciona bem com a porcentagem de micróglia fagocítica (Figura 2F). Para pesquisadores sem experiência em citometria de fluxo, uma análise mais simples apenas com a coloração CD11b pode ser realizada, embora isso inclua neutrófilos e monócitos fagocíticos, bem como microglia. Dentro desta população CD11b + / Ly6C- / Ly6G-, essas células são > 99% de micróglia, conforme julgado pela coloração com os marcadores F4 / 80 e CX3CR1; Esses marcadores podem ser adicionados, mas não são necessários em nossas mãos.
