Um ensaio de citometria de fluxo para identificar subconjuntos de células imunes em células mononucleares do sangue periférico

Resumo

Fonte: Torchia, M. L. G., et al. Discriminação de sete subconjuntos de células imunes por citometria de fluxo de dois fluorocromos. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra uma técnica baseada em citometria de fluxo usando dois fluorocromos para identificar células T CD4⁺ e CD8⁺, células T γδ, células B, células natural killer (NK) e monócitos em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). Ao incubar as células com anticorpos conjugados com fluorocromo contra os marcadores de superfície, os subconjuntos de células são identificados usando uma estratégia ideal de controle citométrico de fluxo.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

NOTA: Este protocolo foi testado em células sanguíneas periféricas isoladas frescas ou congeladas e sangue total.

1. Coloração celular

NOTA: A escolha de pares de fluorocromos praticamente sem sobreposição espectral é importante para reduzir a disseminação de dados devido ao alto transbordamento de um fluorocromo no outro detector de fluorocromo. Para obter uma identificação ideal de todos os subconjuntos de células, fluorocromos com alto rendimento quântico devem ser usados, como pares de anticorpos PE-BV421 e PE-APC.

1. Coloração de PBMC fresco e congelado
   1. Transfira 100 μL de PBMC (1 x 10⁶ células) para uma placa de fundo em V de 96 poços.
      nota: Qualquer número de células menor que 1 x 10⁶ pode ser usado com resultados semelhantes.
   2. Centrifugar a 350 x g durante 3 min em RT e aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Adicione a cada poço 100 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo um corante fixável vivo/morto que reage com amina livre em proteínas por 10 min para marcar células mortas.
   3. Preparar para cada amostra 30 μL de uma mistura contendo todos os anticorpos (anti-CD3. -CD56, TCRγδ no fluorocromo A e anti-CD4, CD8, CD19, CD14 no fluorocromo B). As concentrações de anticorpos são indicadas na Tabela 1 e na Tabela 2. Nesta fase, anticorpos titulados contra diferentes moléculas-alvo e em diferentes fluorocromos também podem ser adicionados (por exemplo, Tabela 3).
      nota: A concentração de anticorpos pode variar dependendo do fabricante e do número do lote. Portanto, testes preliminares devem ser feitos para obter o sinal ideal. PBS, PBS/0,5% de albumina sérica bovina (BSA), PBS/0,2% de azida sódica ou PBS/0,5% BSA/0,1% de azida sódica foram usados com resultados semelhantes para diluir anticorpos. As células também podem ser coradas em volumes diferentes de 30 μL para integrar facilmente essa metodologia aos protocolos de coloração já existentes.
   4. Centrifugar a 350 x g durante 3 min em RT e aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Adicione o coquetel de anticorpos a cada poço e ressuspenda cuidadosamente sem gerar bolhas. Incubar por 30 min em RT no escuro.
      nota: É possível corar as amostras a 4 °C com resultados semelhantes.
   5. Adicione 150 μL de tampão de coloração e centrifugue a 350 x g por 3 min em RT e aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Ressuspenda as células em 200 μL de PBS e adquira dados em um citômetro de fluxo. Se os volumes de coloração forem alterados, certifique-se de uma diluição de pelo menos 20 vezes da mistura de anticorpos original usada para lavar os anticorpos em excesso.
      nota: As células coradas podem ser fixadas em PBS/paraformaldeído a 2%, mantidas em geladeira a 4 °C durante a noite e, em seguida, adquiridas em citômetro de fluxo no dia seguinte.
      cuidado: O paraformaldeído é prejudicial se ingerido e pode causar irritação na pele

2. Titulação de anticorpos

NOTA: A titulação de anticorpos é a etapa mais crítica para obter dados reprodutíveis e de alta qualidade. A titulação de anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 e -TCR γδ segue o procedimento padrão pelo qual a concentração de anticorpo para separar de forma ideal os picos positivos e negativos é derivada pelo índice máximo de coloração. Diluições no pico ou mais perto do pico no lado ascendente da curva do índice de coloração devem ser selecionadas (Figura 1A-C). O anticorpo anti-CD4 é titulado para colocar o pico da população CD4 positiva entre as populações CD3 únicas positivas e as células T CD3⁺/CD8⁺, mais próximo do sinal CD3 único positivo para melhor discriminar as populações CD8dim (células T CD8⁺ γδ e células T NK). Na mesma linha, a titulação de CD56 visa posicionar as células NK CD56⁺ entre a população CD3⁺ e a população CD3^-.

1. Curva máxima do índice de mancha
   NOTA: A titulação de anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 e -TCR γδ segue o procedimento padrão pelo qual a concentração de anticorpo para separar de forma ideal os picos positivos e negativos é derivada por uma curva de índice de coloração máxima. Se anticorpos contra outros marcadores forem adicionados ao painel, eles também precisam ser titulados com uma curva de índice de coloração máxima.
   1. Prepare uma diluição de anticorpos de 2 vezes enchendo 10 poços de uma placa de 96 poços com 40 μL de tampão de coloração. No primeiro poço, aumente o volume final para 80 μL de tampão de coloração e adicione o anticorpo de interesse a uma concentração 4 vezes maior que a sugerida pelo fabricante.
   2. Misture bem e transfira 40 μL para o segundo poço. Misture bem e repita esta etapa para todos os outros poços.
   3. Manchar 10 amostras de PBMC ou sangue total com 30 μL das 10 diferentes diluições de 2 vezes de anticorpos seguindo o protocolo descrito anteriormente.
   4. Adquirir dados com um citómetro de fluxo e representar graficamente o sinal de cada diluição (figura 1A).
   5. Gate nas populações negativas e positivas para cada concentração de anticorpos. Aumentar a concentração de anticorpos pode levar a um fundo mais alto. Portanto, redimensione a porta negativa de acordo.
   6. Para cada concentração de anticorpos, extraia informações sobre a mediana e o desvio padrão para a intensidade fluorescente da população negativa e a mediana para a intensidade fluorescente da população positiva. Calcule, para cada concentração de anticorpos, o índice de coloração com a seguinte fórmula: (intensidade fluorescente média da população positiva — intensidade fluorescente média da população negativa) ÷ (2 x desvio-padrão da intensidade fluorescente da população negativa) (figura 1B).
   7. Plote o índice de coloração versus a concentração de anticorpos expressa como uma fração da diluição do anticorpo (por exemplo, diluição 1:10 = 0,1) e identifique a concentração do anticorpo com o valor máximo do índice de coloração (Figura 1C).
2. Titulação de anticorpos anti-CD4 e -CD56
   NOTA: A titulação de anticorpos anti-CD4 e -CD56 depende da titulação anterior dos outros marcadores no painel de dois fluorocromos. Para o anticorpo anti-CD4, a titulação visa colocar o sinal anti-CD4 entre o sinal duplo CD8⁺/CD3⁺ e a população CD3 única positiva (Figura 1D).
   1. Titular os anticorpos anti-CD4 e CD56 com uma estratégia de diluição de 2 vezes, conforme descrito anteriormente, adicionando concentrações adicionais entre eles para identificar com precisão a faixa de concentração que permite separar as células T CD4⁺ e as células NK das outras populações de células.
   2. Titular o anticorpo anti-CD4 colocando o sinal anti-CD4 entre o sinal duplo CD8⁺/CD3⁺ e a população CD3 única positiva (Figura 1D).
      nota: Deve-se ter cuidado especial para separar claramente as células T CD4⁺ das populações CD8⁺ dim.
   3. Titular o anticorpo anti-CD56 seguindo uma estratégia semelhante à titulação do anticorpo anti-CD4, colocando as células NK entre as populações CD3-negativas e CD3-positivas.

3. Estratégia de Gating

1. Identifique as populações de células linfocíticas e monocíticas e remova as células mortas e a maioria dos glóbulos vermelhos residuais da análise.
   1. Selecione toda a população contendo linfócitos e monócitos com base na área de dispersão direta versus lateral (FSC-A vs SSC-A). Remova os agregados de células da análise por meio da altura de dispersão direta versus largura de dispersão direta (FSC-H vs FSC-W) e altura de dispersão lateral versus largura de dispersão lateral (SSC-H vs SSC-W).
   2. Use um marcador de discriminação vivo/morto para excluir células mortas positivas brilhantes e glóbulos vermelhos residuais da análise. Gate em linfócitos e monócitos com base nos diferentes perfis FSC-A e SSC-A.
2. Estratégia de gating de dois fluorocromos e sete marcadores das populações linfocíticas.
   nota: Dentro do subgrupo CD3 positivo, as células T CD4⁺, CD8⁺ e γδ podem ser separadas usando anticorpos que visam apenas CD4, CD8 e o receptor γδ. De maneira comparável, dentro do subgrupo CD3 negativo, células B, células NK e monócitos podem ser identificados exclusivamente usando anticorpos contra CD19, CD56 e CD14, respectivamente.
   1. Selecione a porta linfocitária e crie um gráfico de pontos com em cada eixo um dos dois fluorocromos usados neste protocolo (Figura 2B).
   2. Gate em células T CD8 ⁺ identificadas como células duplamente positivas CD3 ⁺ / CD8 ⁺ no canto superior direito do gráfico de pontos (Figura 2B). Exclua a população CD8 fraca que pode conter células NKT. Gate em células T CD4⁺ identificadas como população entre as células T CD8⁺ e as populações CD3 únicas positivas. Gate em células T γδ identificadas como células CD3 altas. Subdividir as células T γδ em CD8 positivas e CD8 negativas.
   3. Gate em células NK identificadas como a população entre células CD3-positivas e CD3-negativas. Subdivida as células NK em CD8 positivas e CD8 negativas. Gate em células B identificadas como população CD3 negativa para CD19 ⁺ no canto inferior direito do gráfico de pontos.
   4. Selecione as portas de monócitos e crie um gráfico de pontos com em cada eixo um dos dois fluorocromos usados neste protocolo (Figura 2C). Gate na população CD3^-/CD14⁺.

Tabela 1: Painel de anticorpos usado para a coloração de células imunes de dois fluorocromos de PBMC (combinação BV421-PE).

alvo	clone	Fluorochrome	fornecedor	concentração	propósito
CD3	UCHT1	BV421	Bd	1/20	linhagem
CD56	NCAM16.2	BV421	Bd	1/900
TCRγδ	B1	BV421	bio	1/30
CD4	RPA-T4	Pe	Bd	1/450
CD8	RPA-T8	Pe	Bd	1/20
CD14	M5E2	Pe	Bd	1/15
CD19	HIB19	Pe	Bd	1/300
Células mortas		L/D Azul	Tenente	1/300	Discriminação de Vivos/Mortos
BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies

Tabela 2: Painel de anticorpos usado para a coloração de células imunes de dois fluorocromos de PBMC (combinação APC-PE).

alvo	clone	Fluorochrome	fornecedor	concentração	propósito
CD3	UCHT1	Apc	Bd	1/20	linhagem
CD56	NCAM16.2	Apc	Bd	1/60
TCRγδ	B1	Apc	bio	1/30
CD4	RPA-T4	Pe	Bd	1/450
CD8	RPA-T8	Pe	Bd	1/20
CD14	M5E2	Pe	Bd	1/15
CD19	HIB19	Pe	Bd	1/300
Células mortas		L/D Azul	Tenente	1/300	Discriminação de Vivos/Mortos
BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies

Tabela 3: Painel de anticorpos usado para corar PBMC congelado de um paciente com mieloma múltiplo.

alvo	clone	Fluorochrome	catálogo	fornecedor	concentração	propósito
CD3	UCHT1	BV421	562426	Bd	1/20	linhagem
CD56	NCAM16.2	BV421	562751	Bd	1/900
TCRγδ	B1	BV421	331217	bio	1/30
CD4	RPA-T4	Pe	555347	Bd	1/450
CD8	RPA-T8	Pe	555367	Bd	1/20
CD14	M5E2	Pe	555398	Bd	1/15
CD19	HIB19	Pe	555413	Bd	1/300
CCR7	G043H7	AF647	353217	bio	1/30	diferenciação
CD45RA	HI100	APC-H7	560674	Bd	1/60
CCR4	1G1	PE-Cy7	561034	Bd	1/60	Subconjuntos Th
CCR6	G034-E3	BV605	353419	bio	1/30
CXCR3	1C6/CXCR3	AF488	Rolamento 561730	Bd	1/30
CD57	NK-1	PE-CF594	562488	Bd	1/900	Ativação/Exaustão
HLA-DR	G46-6	BV510	563083	Bd	1/30
CD16	3G8	BUV395	563784	Bd	1/30	NK, ativação de monócitos
Células mortas		L/D Azul	L-23105	Tenente	1/300	Discriminação de Vivos/Mortos

Resultados

Figura 1: Titulação de anticorpos representativos. (A) O gráfico de pontos mostra a expressão de CD8 em PBMC fresco corado com a concentração indicada do anticorpo. (B) A tabela representa a mediana e o desvio padrão da intensidade fluorescente da população CD8+, a intensidade fluorescente mediana CD8- e o índice de coloração derivado para cada concentração testada. ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CD3	BD Biociências	562426	Anticorpo para coloração RRID: AB_11152082
CD56	BD Biociências	562751	Anticorpo para coloração RRID: AB_2732054
TCRgd	BD Biociências	331217	Anticorpo para coloração RRID: AB_2562316
CD4	BD Biociências	555347	Anticorpo para coloração RRID: AB_395752
CD8	BD Biociências	555367	Anticorpo para coloração RRID: AB_395770
CD14	BD Biociências	555398	Anticorpo para coloração RRID: AB_395799
CD19	BD Biociências	555413	Anticorpo para coloração RRID: AB_395813
CD3	BD Biociências	555335	Anticorpo para coloração RRID: AB_398591
CD56	BD Biociências	555518	Anticorpo para coloração RRID: AB_398601
TCRgd	BD Biociências	331211	Anticorpo para coloração RRID: AB_1089215
CCR7	Biolenda	353217	Anticorpo para coloração RRID: AB_10913812
CD45RA	BD Biociências	560674	Anticorpo para coloração RRID: AB_1727497
CCR4	BD Biociências	561034	Anticorpo para coloração RRID: AB_10563066
CCR6	BD Biociências	353419	Anticorpo para coloração RRID: AB_11124539
CXCR3	BD Biociências	Rolamento 561730	Anticorpo para coloração RRID: AB_10894207
CD57	BD Biociências	562488	Anticorpo para coloração RRID: AB_2737625
HLA-DR	BD Biociências	563083	Anticorpo para coloração RRID: AB_2737994
CD16	BD Biociências	563784	Anticorpo para coloração RRID: AB_2744293
Células mortas	Tecnologias de vida	L-23105	Discriminação de vivos/mortos
Placa de fundo em V de 96 poços	Pescador térmico	Rolamento 249570	placa para coloração
Classificador de células FACSAria IIu	BD Biociências		Citômetro de fluxo
FCS Express 6	De Novo Software		Análise FACS
Prisma do Graphpad	Software GraphPad		análise de dados