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1. Código de barras de células sanguíneas lisadas/fixas
- Descongele as amostras de células lisadas/fixas do armazenamento a -80 °C lentamente no gelo; um máximo de 20 amostras podem ser rotuladas com códigos de barras exclusivos e agrupadas usando este sistema. Dilua o buffer de perm de código de barras 10X em 1:10 com PBS; faça tampão suficiente para ~ 3 mL por amostra.
- Encha uma calha não estéril com o CSM e outra com o buffer de perm de código de barras 1X. Adicione 1 mL de CSM gelado a amostras recém-descongeladas, misture bem com uma pipeta e transfira para os respectivos tubos de polipropileno pré-rotulados.
- Pegue uma amostra de 10 μL para contar as células usando um contador de células automatizado ou hemocitômetro. Normalize a contagem de células para 1,5–2 x 106 células por amostra em cada tubo de cluster: remova e descarte o volume de células em excesso acima de 2 x 106 células.
- Centrifugue as células a 600 x g por 5 min em temperatura ambiente. Ressuspenda as células em 1 mL de tampão permanente de código de barras 1X com uma pipeta multicanal e centrifugue a 600 x g por 5 min em temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante.
- Alinhe os tubos de cluster em um rack na mesma ordem indicada na chave do código de barras para que a amostra corresponda ao seu código de barras. Adicione 800 μL de tampão de perm de código de barras 1X por pipeta multicanal a todas as amostras nos tubos de cluster sem tocar no pellet celular com as pontas da pipeta (sem mistura) para reduzir a perda de células. Separe o rack com os tubos do cluster.
- Remova as tiras de tubo do kit de código de barras Pd 20-plex de -20 °C e descongele em temperatura ambiente. Adicione 100 μL de tampão de perm de código de barras 1X, misture bem e transfira 120 μL da mistura de código de barras ressuspensa para as amostras de células correspondentes nos tubos de cluster.
- Misture bem com pipeta multicanal para que não haja contaminação cruzada entre amostras com código de barras individualmente. Incube os tubos do cluster por 30 min em temperatura ambiente para permitir que os códigos de barras rotulem as células.
- Centrifugue a 600 x g por 5 min em temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante e ressuspenda em 1 mL de CSM.
- Centrifugue e ressuspenda no CSM novamente.
nota: Cada amostra agora é rotulada com um código de barras exclusivo e as amostras estão prontas para serem agrupadas.
- Centrifugue a 600 x g por 5 min em temperatura ambiente e aspire o sobrenadante. Com uma única pipeta e usando a mesma ponta, transfira todos os grânulos celulares em ~ 70–80 μL de volume residual para um tubo de poliestireno. NÃO ejete a ponta da pipeta; Separe a pipeta única com esta ponta.
- Com uma pipeta multicanal e novas pontas, adicione ~100 μL de CSM a cada tubo de cluster original para maximizar a recuperação celular. Com a pipeta única com a ponta que foi reservada, transfira todos os pellets celulares em volume residual de ~ 100 μL para o mesmo tubo de poliestireno.
- Adicione CSM para completar o tubo de poliestireno (~3 mL). Conte e registre o número da célula do conjunto de códigos de barras agrupados. Centrifugue a 600 x g por 5 min em temperatura ambiente e aspire o sobrenadante. Prossiga para tingir as amostras com código de barras no mesmo dia.
Nota: É normal esperar ~ 20–30% de perda de células no processo de código de barras.
2. Coloração de células sanguíneas lisadas/fixas com código de barras e preparação para análise em instrumento de citometria de massa
Nota: Cada título 1X de anticorpo de coloração (1 μL de anticorpo por reação de coloração de 100 μL), geralmente pode corar 3–4 x 106 células. Portanto, quando todas as amostras com código de barras são agrupadas em um tubo, a quantidade de anticorpos deve ser aumentada. Se 20 amostras com código de barras totalizarem 30 x 106 células, e cada título 1X puder corar 3–4 x 106 células, a amostra com código de barras requer apenas um título de 10X, em vez de corar cada amostra individualmente, o que exigiria uma quantidade 20X de anticorpo (1X por tubo individual). A concentração do anticorpo em relação ao número de células deve ser cuidadosamente titulada para cada coquetel de anticorpos individual (não discutido aqui).
- Cor as células usando anticorpos (Tabela de Materiais) para coloração superficial e indução de citocinas.
- Faça o coquetel de coloração da superfície calculando a quantidade a ser adicionada e levando em conta o erro de pipetagem (ou seja, se estiver colorindo 20 amostras com código de barras de 2 x 106 células em cada amostra, é necessária uma coloração de título de 10X; para cálculos de volume final, compense o erro de pipetagem fazendo uma solução de coloração final de 10,5X).
- Adicione 10X o valor do volume de coloração da superfície ao pellet de célula com código de barras. Para reduzir a perda de células, com a mesma ponta, misture e meça o volume de manchas superficiais e pellets de células.
- Com base no volume de células e no coquetel de coloração, adicione CSM a um volume final de coloração de 50 μL por número de amostras de células (ou seja, se estiver executando um conjunto de 20 amostras, 50 μL X 20 = 1 mL). Incubar durante 30 min a 4 °C. Agitar a amostra de 15 em 15 min para promover uma coloração uniforme.
- Durante a incubação da mancha superficial, prepare o tampão Perm/Wash (Tabela de Materiais) diluindo 1:10 com ddH2O. Prepare volumes de 2 mL para permeabilização e 5 mL para lavagem. Conservar a 4 °C ou sobre gelo.
- Complete o tubo de coloração da superfície com CSM e centrifugue a 600 x g a 4 °C por 5 min. Aspire o sobrenadante. Ressuspenda a amostra com código de barras em 2 mL de tampão Perm/Wash de diluição a 4 °C, 1:10. Incubar a 4 °C durante 20–30 min para permeabilizar totalmente as células.
- Centrifugar a 600 x g a 4 °C durante 5 min e aspirar o sobrenadante.
- Para coloração intracelular, siga etapas de coloração semelhantes (como para coloração de superfície). No entanto, use o tampão Perm/Wash de diluição de 4 °C, 1:10 em vez do CSM para fazer o volume total de coloração de modo que as células permaneçam em um ambiente permeabilizante durante toda a coloração intracelular.
- Adicione o coquetel de anticorpos intracelulares ao pellet de células coradas e permeabilizadas na superfície (etapas 2.1.2–2.1.7). Traga o volume total de coloração para 50 μL por número de amostras de células. Incubar durante 60 min a 4 °C. Agitar a amostra de 15 em 15 min para garantir uma coloração uniforme.
- Durante a coloração intracelular, prepare a solução intercaladora: 900 μL de PBS filtrado + 100 μL de PFA filtrado a 16% (concentração final de 1,6% de PFA) + 0,2 μL de 500 uM de corante intercalador (Tabela de Materiais).
- Complete o pellet celular + coquetel de anticorpos intracelulares com tampão de perm/lavagem 1:10 frio.
- Centrifugar a 600 x g a 4 °C durante 5 min e aspirar o sobrenadante. Complete o tubo de coloração com CSM. Conte e registre o número da célula. Centrifugar a 600 x g a 4 °C durante 5 min e aspirar o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 mL de solução intercaladora da etapa 4.9. Incubar durante pelo menos 20 minutos à temperatura ambiente para intercalação completa ou durante a noite a 4 °C (as amostras em solução intercaladora podem permanecer a 4 °C até 1 semana antes de serem executadas no instrumento de citometria de massa).
- Preparar as células para o instrumento de citometria de massa.
- Complete o tubo com 3 mL de ddH2O filtrado e centrifugue a 600 x g por 5 min a 4 ° C. Ressuspenda as células em 3 mL de ddH2O filtrado. Passe esta suspensão por um filtro de 100 μm para remover quaisquer detritos ou agregados que possam entupir o instrumento de citometria de massa.
- Conte e registre o número da célula após a filtração. Centrifugue a 600 x g por 5 min a 4 °C
- Preparar a solução de esferas de calibração (Tabela de Materiais) diluindo-a 1:10 em ddH2O filtrado.
- Ressuspenda as células coradas no volume necessário de solução de grânulo de calibração diluída 1:10 para atingir uma concentração celular de ~ 1 x 106 células / mL.
nota: Para um CyTOF1 a 45 μL/min, o ideal recomendado é 5 x 105 células/mL; para Helios a 30 μL / min, 7,5 x 105 células / mL.
- Prossiga para executar a amostra no instrumento de citometria de massa.