1. Preparação de oligonucleotídeos
- Dissolver o ácido desoxirribonucléico (ADN) da fita ligante em água (resistividade de 18,2 MΩ, utilizada em todo o protocolo). Vortex e gire a solução com uma centrífuga de mesa. Ajuste o volume de água de forma que a concentração final seja de 1 mM. Validar a concentração utilizando um espectrofotómetro nanodrop para medir a absorvância a 260 nm e determinar a concentração final com base no coeficiente de extinção do oligonucleótido.
nota: A fita ligante tem uma modificação em cada terminal, 5' amina e 3' biotina, para se conjugar com o fluoróforo e apresentar o ligante biotinilado. O grupo amina na fita ligante precisa ser conjugado com um fluoróforo. O corante Cy3B é usado para esta conjugação devido ao seu alto brilho e fotoestabilidade, mas geralmente não é oferecido comercialmente e requer conjugação interna. Assim, a seção a seguir descreve a conjugação entre aminas e corantes de éster N-hidroxisuccinimida (NHS). Para usuários finais que não têm acesso a instalações ou recursos para modificação de ácidos nucleicos, os ácidos nucléicos modificados podem ser adquiridos de fornecedores de síntese de DNA personalizados que oferecem corantes brilhantes e fotoestáveis, como a família de corantes Alexa e Atto.
- Prepare 10x solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 1 M de bicarbonato de sódio (NaHCO3). Misture 10 μL da solução de fita ligante de amina 1 mM (10 nmol) com 10 μL de 10x PBS, 10 μL de NaHCO3 1 M e 60 μL de H2O. Dissolva 50 μg de N-hidroxisuccinimida Cy3B (éster NHS) em 10 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) imediatamente antes do uso e adicione à mistura para obter um volume total de reação de 100 μL. Adicione o éster Cy3B NHS último. Deixar reagir à temperatura ambiente durante 1 h ou 4 °C durante a noite.
- Prepare o fio de travamento Atto647N conjugando o fio de travamento de amina com o éster Atto647N NHS. Prepare 10x PBS e 1 M NaHCO3 solução. Misture 10 μL da solução de fita bloqueada de amina 1 mM (10 nmol) com 10 μL de 10x PBS, 10 μL de 1 M NaHCO3 e 60 μL de H2O. Dissolva 50 μg de éster Atto647N NHS em 10 μL de DMSO imediatamente antes de usar e adicione à mistura para um volume total de reação de 100 μL. Adicione o éster Atto647N NHS por último. Deixar reagir à temperatura ambiente durante 1 h ou 4 °C durante a noite.
- Após as reações, remova os subprodutos, o excesso de corante e os sais por filtração em gel de dessalinização P2. Diluir a mistura de reacção com H2O até obter um volume total de 300 μl, o que é adequado para a fase de purificação subsequente da cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). Adicione 650 μL de gel P2 hidratado a um dispositivo centrífugo e gire a 18.000 x g por 1 min. Remova o líquido na parte inferior do dispositivo, adicione a mistura de reação à coluna contendo o gel P2, gire a 18.000 x g por 1 min e colete a mistura de reação na parte inferior do dispositivo.
nota: O gel P2 deve ser hidratado pelo menos 4 h antes do uso com H2O.
- Purificar a mistura de reacção dessalinizada com HPLC utilizando uma coluna C18 designada para a purificação de oligonucleótidos, com o solvente A: acetato de trietilamónio 0,1 M (TEAA) em H2O e B: acetonitrilo (ACN) como fase móvel para uma eluição de gradiente linear de 10-100% B durante 50 min a um débito de 0,5 ml/min. Injectar a mistura de reacção dessalinizada em HPLC de fase inversa com um circuito de injecção de 500 μL para purificação. Recolher o produto que tem um pico de absorvância para o ácido desoxirribonucleico, ADN (260 nm) e um pico de absorvância para o fluoróforo (560 nm para Cy3B e 647 nm para Atto647N) e secá-los num concentrador centrífugo a vácuo durante a noite (ver figura 1A).
- Reconstituir o oligocorante seco em 100 μL de água. Determine a concentração da fita ligante Cy3B e da fita de bloqueio Atto647N com o espectrofotômetro nanodrop. Certifique-se de que a proporção de rotulagem do corante esteja próxima de 1:1. Corrigir a absorvância de 260 nm do corante, se necessário, ao determinar a concentração de oligonucleótidos.
- Valide o produto purificado com espectrometria de massa por tempo de voo de ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF-MS) usando 3-hidroxipropionaldeído (3-HPA) como substrato em 50% ACN/H2O com ácido trifluoracético (TFA) a 0,1% e 5 mg/mL de citrato de amônio usando 0,5 μL do produto a 1-5 μM para preparação de amostra MALDI-TOF-MS. Um exemplo de espectro de massa pode ser encontrado na Figura 1B.
- Dissolver o fio grampo e o fio de ancoragem de têmpera em água e certificar-se de que a concentração das soluções-mãe se situa entre 50 e 100 μM.
nota: O fio hairpin não é modificado e pode ser sintetizado diretamente de um fornecedor. O fio de ancoragem tem um grupo de ancoragem tiol e um quencher BHQ2 e pode ser sintetizado diretamente de um fornecedor.
- Alíquota de todos os oligonucleotídeos. Para uso e armazenamento de curto prazo, armazene esses oligonucleotídeos a 4 °C. Para armazenamento de longo prazo, congele e mantenha-os a -20 °C. Neste ponto, todos os oligonucleotídeos estão prontos para a montagem da sonda de tensão do DNA.
nota: Ciclos repetidos de congelamento e descongelamento não são problemáticos para oligonucleotídeos.
2. Preparação da superfície
NOTA: A preparação dos substratos da sonda de tensão do gancho de cabelo do DNA leva dois dias. A sonda de tensão de gancho de cabelo de DNA será funcionalizada em lamínulas de vidro.
- Dia 1
- Colocar as lamínulas de 25 mm num suporte de politetrafluoretileno num copo de 50 ml. Cada rack pode conter até 8 lamínulas. Enxágue as lamínulas submergindo-as em água três vezes.
- Adicionar 40 ml de uma solução de etanol na proporção de 1:1 (v:v) misturada com água ao copo que contém a grelha e as lamínulas e fechar o copo com uma película de parafina.
- Sonicar o copo durante 15 min num produto de limpeza ultrassónico (frequência de funcionamento 35 KHz) para limpar as lamínulas. Após a sonicação, descarte o líquido e lave o béquer com a grelha e as lamínulas com água pelo menos 6 vezes para remover qualquer solvente orgânico restante.
- Prepare a solução fresca de Piranha misturando ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio na proporção de 3:1. Para fazer 40 mL de solução de Piranha, adicione 30 mL de ácido sulfúrico a um béquer limpo de 50 mL primeiro e, em seguida, adicione lentamente 10 mL de peróxido de hidrogênio, H2O2. A solução de Piranha aquecerá e borbulhará rapidamente com a adição do H2O2. Misture delicadamente a piranha usando a ponta de uma pipeta de vidro.
- Em seguida, transfira a prateleira que contém as lamínulas para o copo contendo a solução de Piranha suavemente misturada para condicionamento (Figura 2A). Deixe a solução de Piranha hidroxilar e limpe as lamínulas por 30 min em temperatura ambiente. Após o condicionamento da piranha, transfira o rack usando uma pinça de aço ou politetrafluoretileno para um béquer limpo de 50 mL com água e enxágue novamente com água pelo menos 6 vezes.
cuidado: Grandes quantidades de substâncias orgânicas podem reagir vigorosamente com a solução de Piranha e podem causar uma explosão. Tenha cuidado e trabalhe sempre com a solução Piranha em uma hotte. Certifique-se de usar jaleco, luvas e óculos de segurança. Nunca armazene a solução fresca de Piranha em um recipiente lacrado.
nota: A proporção de peróxido de hidrogênio para ácido sulfúrico deve ser mantida abaixo de 1:2 (v:v) e nunca deve exceder 1:1. Ao submergir o rack com lamínulas na solução de Piranha, coloque-as na solução lenta e cuidadosamente. Não descarte a solução imediatamente após a corrosão, pois ela ainda está ativa e quente. Deixe-o no copo durante a noite antes de despejá-lo no recipiente de resíduos ácidos.
- Mergulhe o rack que contém as lamínulas em um béquer de 50 mL com 40 mL de etanol para remover a água. Descarte o etanol e repita 3 vezes para garantir que a água foi removida.
- Em seguida, mergulhe o rack em 3% de aminopropiltrietoxisilano (APTES) (v/v) em 40 mL de etanol para reagir com o -OH nas lamínulas por 1 h em temperatura ambiente (Figura 2B).
nota: O etanol pode ser substituído por acetona.
- Enxágue as superfícies 6 vezes submergindo-as em 40 mL de etanol e seque no forno a 80 °C por 20 min. Após o arrefecimento, conservar as lamínulas secas modificadas com aminas a -20 °C para utilização futura (até 6 meses).
- Cubra o lado interno inferior de placas de Petri de plástico de 10 cm de diâmetro com filme de parafina. O filme de parafina evita que as lamínulas deslizem para dentro da placa de Petri e ajuda a manter a solução para as próximas etapas de funcionalização nas lamínulas. Coloque as lamínulas modificadas com amina resfriadas nas placas de Petri. O lado a ser funcionalizado deve estar voltado para cima.
- Para modificar os grupos amina nas lamínulas, adicione 300 μL de ácido lipóico a 0,5% p/v de poli(etilenoglicol) (PEG) NHS (LA-PEG-SC) e 2,5% p/v mPEG NHS (mPEG-SC) em 0,1 M NaHCO3 em cada lamínula e incube por 1 h em temperatura ambiente (Figura 2C). Para cada lamínula de 25 mm, pesar 1,5 mg de LA-PEG-SC e 7,5 mg de mPEG-SC. Dissolva os reagentes do NHS imediatamente antes de adicioná-los às superfícies, pois eles têm uma meia-vida curta (~ 10 min) em uma solução aquosa à temperatura ambiente. Após a reação, enxágue as superfícies 3 vezes com água.
nota: A reação do NHS pode ser realizada a 4 °C durante a noite. Os reagentes NHS têm uma meia-vida mais longa antes da hidrólise a 4 °C, que é em torno de 4-6 h. Isso resultará em um procedimento de preparação de superfície de três dias.
- Adicione 100 μL de bicarbonato de sódio 0,1 M, NaHCO3 contendo 1 mg / mL de acetato de sulfo-NHS a um conjunto de lamínulas "sanduíche" (duas lamínulas voltadas uma para a outra com tampão de reação no meio). Permita que a passivação ocorra por pelo menos 30 min. Para economizar o reagente, essa etapa pode ser feita com 50 μL de acetato de sulfo-NHS 1 mg/mL. Enxágüe com água três vezes após a passivação.
- Adicione 0,5 mL de nanopartículas de ouro (AuNP, 8,8 nm, ácido tânico, 0,05 mg / mL) a cada lamínula e incube por 30 min em temperatura ambiente ( Figura 2D ). Para economizar o reagente, esta etapa também pode ser feita imprensando duas lamínulas. Certifique-se de que nenhum sal esteja presente no sistema das etapas anteriores para evitar a agregação de nanopartículas de ouro. Não deixe as lamínulas secarem após esta etapa.
- Enquanto isso, pré-hibridize o grampo de cabelo de 4,7 pN, a fita de ligante Cy3B e a fita de âncora BHQ2 que formam as sondas de tensão de DNA construídas em uma proporção de 1,1: 1: 1 em cloreto de sódio (NaCl) 1 M a 300 nM em um tubo de reação em cadeia da polimerase (PCR). Recozer os fios aquecendo a solução até 95 °C por 5 min e, em seguida, esfriar gradualmente diminuindo a temperatura para 20 °C em 30 min em um termociclador.
- Enxágue as lamínulas com água três vezes após 30 minutos de incubação com nanopartículas de ouro. Adicione uma fita de ancoragem BHQ2 adicional (de estoque de 100 μM) à solução de DNA recozida para fazer a proporção entre a fita de ancoragem BHQ2 e a fita de ligante Cy3B 10:1. Neste ponto, a solução de DNA deve conter 300 nM de construção de sonda de tensão e 2,7 μM de fita BHQ2. Adicione 100 μL por duas lamínulas para fazer o "sanduíche" (Figura 2E).
- Coloque cuidadosamente uma bola de tecido de laboratório úmido na placa de Petri (longe de lamínulas) e sele a placa com filme de parafina para evitar que a solução seque. Cubra o prato com papel alumínio e incube a 4 °C durante a noite.
- Dia 2
- Lave o excesso de sondas das lamínulas com 1x PBS. Verifique a qualidade da superfície da sonda de tensão do DNA sob um microscópio epifluorescente.
- Prepare 40 μg / mL de estreptavidina em 1x PBS e incube em lamínulas por 30 min em temperatura ambiente ( Figura 2F ). Normalmente, 100 μL são suficientes para uma lamínula de 25 mm. Enxágüe com PBS 3 vezes após a incubação para remover o excesso de estreptavidina.
- Prepare 40 μg/mL de anticorpo/ligante biotinilado em 1x PBS. Adicione 50-100 μL por sanduíche e incube por 30 min em temperatura ambiente ( Figura 2G ). Enxágüe com PBS três vezes após a incubação para lavar a quantidade excessiva de anticorpo/ligante biotinilado.
- Monte as câmaras de imagem limpas com superfícies com cuidado. As superfícies podem ser facilmente rachadas ao apertar as câmaras. Adicione 0,5-1 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS) às câmaras de imagem e mantenha-as prontas para imagens com células (Figura 2H).
3. Forças receptoras celulares de imagem
- Prepare células imunes de interesse em HBSS em 1-2 x 106 células/mL.
nota: As células virgens OT-1 CD8+ são usadas como exemplo neste artigo. Purifique as células T virgens OT-1 CD8+ do baço de camundongos sacrificados usando o kit de isolamento de células T CD8+ de camundongo MACS com um separador de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) seguindo as instruções do fabricante. Isole e enriqueça as células T CD8 + removendo quaisquer células T não CD8 + às quais o coquetel de anticorpos depletor magnético se liga. Ressuspenda as células T virgens OT-1 CD8+ purificadas em HBSS a 2 x 106 células/mL e mantenha no gelo antes de usar.
- Verifique a qualidade da superfície da sonda de tensão em grampo de cabelo de DNA sob um microscópio de fluorescência (objetiva de 100x) para controle de qualidade antes de adicionar ligantes ou células de revestimento. Obter imagens e quantificar a intensidade média de fundo no canal Cy3B de uma superfície de sonda de tensão de gancho de cabelo de DNA de pelo menos 5 posições diferentes e 3 réplicas. Mantenha as condições de aquisição de imagens consistentes para que esse valor possa ser usado como um marcador confiável da qualidade da superfície e da densidade da sonda (Figura 3C).
nota: Quantificar o número de fitas de DNA por nanopartícula de ouro e o número de nanopartículas de ouro por μm2 nas primeiras vezes de preparação da superfície de acordo com a literatura, o que pode ser usado como outro marcador confiável da qualidade da superfície.
- Coloque ~ 4 x 104 - 10 x 104 células em cada lamínula funcionalizada da sonda de tensão de DNA e permita que elas se prendam e se espalhem por ~ 15 min em temperatura ambiente.
- À medida que as células são colocadas nas sondas de tensão do gancho de DNA e começam a se espalhar, obtenha imagens dos sinais de fluorescência que são gerados no canal Cy3B com a objetiva de 100x (Figura 2I).
- Depois que as células começarem a produzir sinal de tensão em tempo real na superfície da sonda de tensão em grampo de DNA no canal Cy3B, adquira imagens nos canais Cy3B e Atto647N (a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) oferece melhor relação sinal-ruído do que a epifluorescência). Posteriormente, adicione a fita Atto647N às câmaras de imagem a uma concentração final de 200 nM para hibridização mecanicamente seletiva.
- Após 10 minutos de incubação, remova rápida e suavemente o tampão contendo o fio de travamento fluorescente Atto647N e substitua-o por sais balanceados de Hank frescos. Imagem nos canais Cy3B e Atto647N novamente e determine o coeficiente de correlação de Pearson com o software Fiji.
- No momento de interesse para a investigação, introduza uma fita de bloqueio não fluorescente nas células da câmara de imagem para armazenar o sinal de tensão. Preparar o fio bloqueado (100 μM) e adicionar às células numa concentração final de 1 μM. Pipetar suavemente para misturar. A duração do bloqueio pode variar, mas 10 min é o tempo recomendado.
- Adquira filmes de lapso de tempo ou imagens de ponto final em epifluorescência para mapeamento qualitativo de tensão e análise quantitativa, conforme necessário (Figura 2J e Figura 4).
nota: Se a medição de tensão em vários pontos de tempo for desejada, inicie o apagamento dos sinais de tensão armazenados pela adição de uma fita de desbloqueio. Para evitar o enxágue excessivo, uma concentração final mais alta da fita de desbloqueio a 2 μM é usada para iniciar uma reação de deslocamento da fita mediada pelo apoio do pé com a fita de travamento por 3 min, que apaga os sinais armazenados ( Figura 2J ). Enxágue suavemente o excesso de oligonucleotídeos com HBSS. A superfície da sonda de tensão em grampo de DNA e as células estão prontas para outra rodada de armazenamento e mapeamento de tensão. O desbloqueio de sinais de tensão não é necessário se apenas um ponto no tempo for de interesse no estudo.
