Usando sondas de tensão baseadas em DNA para avaliar as forças receptoras aplicadas pelas células imunes

Resumo

Fonte: Ma, R. et al., Sondas de tensão de DNA para mapear as forças transitórias do receptor de piconewton por células imunes. (2021)

O vídeo demonstra um método para avaliar as forças do receptor aplicadas por células imunes usando nanopartículas de ouro ancoradas em polietilenoglicol e sondas de tensão de gancho de cabelo de DNA. As interações de células T CD8-positivas desencadeiam o desdobramento da sonda, emitindo fluorescência enquanto as fitas de bloqueio sustentam o sinal para quantificar as forças aplicadas pelas células imunes.

Protocolo

1. Preparação de oligonucleotídeos

1. Dissolver o ácido desoxirribonucléico (ADN) da fita ligante em água (resistividade de 18,2 MΩ, utilizada em todo o protocolo). Vortex e gire a solução com uma centrífuga de mesa. Ajuste o volume de água de forma que a concentração final seja de 1 mM. Validar a concentração utilizando um espectrofotómetro nanodrop para medir a absorvância a 260 nm e determinar a concentração final com base no coeficiente de extinção do oligonucleótido.
   nota: A fita ligante tem uma modificação em cada terminal, 5' amina e 3' biotina, para se conjugar com o fluoróforo e apresentar o ligante biotinilado. O grupo amina na fita ligante precisa ser conjugado com um fluoróforo. O corante Cy3B é usado para esta conjugação devido ao seu alto brilho e fotoestabilidade, mas geralmente não é oferecido comercialmente e requer conjugação interna. Assim, a seção a seguir descreve a conjugação entre aminas e corantes de éster N-hidroxisuccinimida (NHS). Para usuários finais que não têm acesso a instalações ou recursos para modificação de ácidos nucleicos, os ácidos nucléicos modificados podem ser adquiridos de fornecedores de síntese de DNA personalizados que oferecem corantes brilhantes e fotoestáveis, como a família de corantes Alexa e Atto.
2. Prepare 10x solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 1 M de bicarbonato de sódio (NaHCO₃). Misture 10 μL da solução de fita ligante de amina 1 mM (10 nmol) com 10 μL de 10x PBS, 10 μL de NaHCO₃ 1 M e 60 μL de H₂O. Dissolva 50 μg de N-hidroxisuccinimida Cy3B (éster NHS) em 10 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) imediatamente antes do uso e adicione à mistura para obter um volume total de reação de 100 μL. Adicione o éster Cy3B NHS último. Deixar reagir à temperatura ambiente durante 1 h ou 4 °C durante a noite.
3. Prepare o fio de travamento Atto647N conjugando o fio de travamento de amina com o éster Atto647N NHS. Prepare 10x PBS e 1 M NaHCO₃ solução. Misture 10 μL da solução de fita bloqueada de amina 1 mM (10 nmol) com 10 μL de 10x PBS, 10 μL de 1 M NaHCO₃ e 60 μL de H₂O. Dissolva 50 μg de éster Atto647N NHS em 10 μL de DMSO imediatamente antes de usar e adicione à mistura para um volume total de reação de 100 μL. Adicione o éster Atto647N NHS por último. Deixar reagir à temperatura ambiente durante 1 h ou 4 °C durante a noite.
4. Após as reações, remova os subprodutos, o excesso de corante e os sais por filtração em gel de dessalinização P2. Diluir a mistura de reacção com H₂O até obter um volume total de 300 μl, o que é adequado para a fase de purificação subsequente da cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). Adicione 650 μL de gel P2 hidratado a um dispositivo centrífugo e gire a 18.000 x g por 1 min. Remova o líquido na parte inferior do dispositivo, adicione a mistura de reação à coluna contendo o gel P2, gire a 18.000 x g por 1 min e colete a mistura de reação na parte inferior do dispositivo.
   nota: O gel P2 deve ser hidratado pelo menos 4 h antes do uso com H₂O.
5. Purificar a mistura de reacção dessalinizada com HPLC utilizando uma coluna C18 designada para a purificação de oligonucleótidos, com o solvente A: acetato de trietilamónio 0,1 M (TEAA) em H₂O e B: acetonitrilo (ACN) como fase móvel para uma eluição de gradiente linear de 10-100% B durante 50 min a um débito de 0,5 ml/min. Injectar a mistura de reacção dessalinizada em HPLC de fase inversa com um circuito de injecção de 500 μL para purificação. Recolher o produto que tem um pico de absorvância para o ácido desoxirribonucleico, ADN (260 nm) e um pico de absorvância para o fluoróforo (560 nm para Cy3B e 647 nm para Atto647N) e secá-los num concentrador centrífugo a vácuo durante a noite (ver figura 1A).
6. Reconstituir o oligocorante seco em 100 μL de água. Determine a concentração da fita ligante Cy3B e da fita de bloqueio Atto647N com o espectrofotômetro nanodrop. Certifique-se de que a proporção de rotulagem do corante esteja próxima de 1:1. Corrigir a absorvância de 260 nm do corante, se necessário, ao determinar a concentração de oligonucleótidos.
7. Valide o produto purificado com espectrometria de massa por tempo de voo de ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF-MS) usando 3-hidroxipropionaldeído (3-HPA) como substrato em 50% ACN/H₂O com ácido trifluoracético (TFA) a 0,1% e 5 mg/mL de citrato de amônio usando 0,5 μL do produto a 1-5 μM para preparação de amostra MALDI-TOF-MS. Um exemplo de espectro de massa pode ser encontrado na Figura 1B.
8. Dissolver o fio grampo e o fio de ancoragem de têmpera em água e certificar-se de que a concentração das soluções-mãe se situa entre 50 e 100 μM.
   nota: O fio hairpin não é modificado e pode ser sintetizado diretamente de um fornecedor. O fio de ancoragem tem um grupo de ancoragem tiol e um quencher BHQ2 e pode ser sintetizado diretamente de um fornecedor.
9. Alíquota de todos os oligonucleotídeos. Para uso e armazenamento de curto prazo, armazene esses oligonucleotídeos a 4 °C. Para armazenamento de longo prazo, congele e mantenha-os a -20 °C. Neste ponto, todos os oligonucleotídeos estão prontos para a montagem da sonda de tensão do DNA.
   nota: Ciclos repetidos de congelamento e descongelamento não são problemáticos para oligonucleotídeos.

2. Preparação da superfície

NOTA: A preparação dos substratos da sonda de tensão do gancho de cabelo do DNA leva dois dias. A sonda de tensão de gancho de cabelo de DNA será funcionalizada em lamínulas de vidro.

1. Dia 1
   1. Colocar as lamínulas de 25 mm num suporte de politetrafluoretileno num copo de 50 ml. Cada rack pode conter até 8 lamínulas. Enxágue as lamínulas submergindo-as em água três vezes.
   2. Adicionar 40 ml de uma solução de etanol na proporção de 1:1 (v:v) misturada com água ao copo que contém a grelha e as lamínulas e fechar o copo com uma película de parafina.
   3. Sonicar o copo durante 15 min num produto de limpeza ultrassónico (frequência de funcionamento 35 KHz) para limpar as lamínulas. Após a sonicação, descarte o líquido e lave o béquer com a grelha e as lamínulas com água pelo menos 6 vezes para remover qualquer solvente orgânico restante.
   4. Prepare a solução fresca de Piranha misturando ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio na proporção de 3:1. Para fazer 40 mL de solução de Piranha, adicione 30 mL de ácido sulfúrico a um béquer limpo de 50 mL primeiro e, em seguida, adicione lentamente 10 mL de peróxido de hidrogênio, H₂O₂. A solução de Piranha aquecerá e borbulhará rapidamente com a adição do H₂O₂. Misture delicadamente a piranha usando a ponta de uma pipeta de vidro.
   5. Em seguida, transfira a prateleira que contém as lamínulas para o copo contendo a solução de Piranha suavemente misturada para condicionamento (Figura 2A). Deixe a solução de Piranha hidroxilar e limpe as lamínulas por 30 min em temperatura ambiente. Após o condicionamento da piranha, transfira o rack usando uma pinça de aço ou politetrafluoretileno para um béquer limpo de 50 mL com água e enxágue novamente com água pelo menos 6 vezes.
      cuidado: Grandes quantidades de substâncias orgânicas podem reagir vigorosamente com a solução de Piranha e podem causar uma explosão. Tenha cuidado e trabalhe sempre com a solução Piranha em uma hotte. Certifique-se de usar jaleco, luvas e óculos de segurança. Nunca armazene a solução fresca de Piranha em um recipiente lacrado.
      nota: A proporção de peróxido de hidrogênio para ácido sulfúrico deve ser mantida abaixo de 1:2 (v:v) e nunca deve exceder 1:1. Ao submergir o rack com lamínulas na solução de Piranha, coloque-as na solução lenta e cuidadosamente. Não descarte a solução imediatamente após a corrosão, pois ela ainda está ativa e quente. Deixe-o no copo durante a noite antes de despejá-lo no recipiente de resíduos ácidos.
   6. Mergulhe o rack que contém as lamínulas em um béquer de 50 mL com 40 mL de etanol para remover a água. Descarte o etanol e repita 3 vezes para garantir que a água foi removida.
   7. Em seguida, mergulhe o rack em 3% de aminopropiltrietoxisilano (APTES) (v/v) em 40 mL de etanol para reagir com o -OH nas lamínulas por 1 h em temperatura ambiente (Figura 2B).
      nota: O etanol pode ser substituído por acetona.
   8. Enxágue as superfícies 6 vezes submergindo-as em 40 mL de etanol e seque no forno a 80 °C por 20 min. Após o arrefecimento, conservar as lamínulas secas modificadas com aminas a -20 °C para utilização futura (até 6 meses).
   9. Cubra o lado interno inferior de placas de Petri de plástico de 10 cm de diâmetro com filme de parafina. O filme de parafina evita que as lamínulas deslizem para dentro da placa de Petri e ajuda a manter a solução para as próximas etapas de funcionalização nas lamínulas. Coloque as lamínulas modificadas com amina resfriadas nas placas de Petri. O lado a ser funcionalizado deve estar voltado para cima.
   10. Para modificar os grupos amina nas lamínulas, adicione 300 μL de ácido lipóico a 0,5% p/v de poli(etilenoglicol) (PEG) NHS (LA-PEG-SC) e 2,5% p/v mPEG NHS (mPEG-SC) em 0,1 M NaHCO₃ em cada lamínula e incube por 1 h em temperatura ambiente (Figura 2C). Para cada lamínula de 25 mm, pesar 1,5 mg de LA-PEG-SC e 7,5 mg de mPEG-SC. Dissolva os reagentes do NHS imediatamente antes de adicioná-los às superfícies, pois eles têm uma meia-vida curta (~ 10 min) em uma solução aquosa à temperatura ambiente. Após a reação, enxágue as superfícies 3 vezes com água.
       nota: A reação do NHS pode ser realizada a 4 °C durante a noite. Os reagentes NHS têm uma meia-vida mais longa antes da hidrólise a 4 °C, que é em torno de 4-6 h. Isso resultará em um procedimento de preparação de superfície de três dias.
   11. Adicione 100 μL de bicarbonato de sódio 0,1 M, NaHCO₃ contendo 1 mg / mL de acetato de sulfo-NHS a um conjunto de lamínulas "sanduíche" (duas lamínulas voltadas uma para a outra com tampão de reação no meio). Permita que a passivação ocorra por pelo menos 30 min. Para economizar o reagente, essa etapa pode ser feita com 50 μL de acetato de sulfo-NHS 1 mg/mL. Enxágüe com água três vezes após a passivação.
   12. Adicione 0,5 mL de nanopartículas de ouro (AuNP, 8,8 nm, ácido tânico, 0,05 mg / mL) a cada lamínula e incube por 30 min em temperatura ambiente ( Figura 2D ). Para economizar o reagente, esta etapa também pode ser feita imprensando duas lamínulas. Certifique-se de que nenhum sal esteja presente no sistema das etapas anteriores para evitar a agregação de nanopartículas de ouro. Não deixe as lamínulas secarem após esta etapa.
   13. Enquanto isso, pré-hibridize o grampo de cabelo de 4,7 pN, a fita de ligante Cy3B e a fita de âncora BHQ2 que formam as sondas de tensão de DNA construídas em uma proporção de 1,1: 1: 1 em cloreto de sódio (NaCl) 1 M a 300 nM em um tubo de reação em cadeia da polimerase (PCR). Recozer os fios aquecendo a solução até 95 °C por 5 min e, em seguida, esfriar gradualmente diminuindo a temperatura para 20 °C em 30 min em um termociclador.
   14. Enxágue as lamínulas com água três vezes após 30 minutos de incubação com nanopartículas de ouro. Adicione uma fita de ancoragem BHQ2 adicional (de estoque de 100 μM) à solução de DNA recozida para fazer a proporção entre a fita de ancoragem BHQ2 e a fita de ligante Cy3B 10:1. Neste ponto, a solução de DNA deve conter 300 nM de construção de sonda de tensão e 2,7 μM de fita BHQ2. Adicione 100 μL por duas lamínulas para fazer o "sanduíche" (Figura 2E).
   15. Coloque cuidadosamente uma bola de tecido de laboratório úmido na placa de Petri (longe de lamínulas) e sele a placa com filme de parafina para evitar que a solução seque. Cubra o prato com papel alumínio e incube a 4 °C durante a noite.
2. Dia 2
   1. Lave o excesso de sondas das lamínulas com 1x PBS. Verifique a qualidade da superfície da sonda de tensão do DNA sob um microscópio epifluorescente.
   2. Prepare 40 μg / mL de estreptavidina em 1x PBS e incube em lamínulas por 30 min em temperatura ambiente ( Figura 2F ). Normalmente, 100 μL são suficientes para uma lamínula de 25 mm. Enxágüe com PBS 3 vezes após a incubação para remover o excesso de estreptavidina.
   3. Prepare 40 μg/mL de anticorpo/ligante biotinilado em 1x PBS. Adicione 50-100 μL por sanduíche e incube por 30 min em temperatura ambiente ( Figura 2G ). Enxágüe com PBS três vezes após a incubação para lavar a quantidade excessiva de anticorpo/ligante biotinilado.
   4. Monte as câmaras de imagem limpas com superfícies com cuidado. As superfícies podem ser facilmente rachadas ao apertar as câmaras. Adicione 0,5-1 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS) às câmaras de imagem e mantenha-as prontas para imagens com células (Figura 2H).

3. Forças receptoras celulares de imagem

1. Prepare células imunes de interesse em HBSS em 1-2 x 10⁶ células/mL.
   nota: As células virgens OT-1 CD8+ são usadas como exemplo neste artigo. Purifique as células T virgens OT-1 CD8⁺ do baço de camundongos sacrificados usando o kit de isolamento de células T CD8⁺ de camundongo MACS com um separador de classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) seguindo as instruções do fabricante. Isole e enriqueça as células T CD8 ⁺ removendo quaisquer células T não CD8 + às quais o coquetel de anticorpos depletor magnético se liga. Ressuspenda as células T virgens OT-1 CD8+ purificadas em HBSS a 2 x 10⁶ células/mL e mantenha no gelo antes de usar.
2. Verifique a qualidade da superfície da sonda de tensão em grampo de cabelo de DNA sob um microscópio de fluorescência (objetiva de 100x) para controle de qualidade antes de adicionar ligantes ou células de revestimento. Obter imagens e quantificar a intensidade média de fundo no canal Cy3B de uma superfície de sonda de tensão de gancho de cabelo de DNA de pelo menos 5 posições diferentes e 3 réplicas. Mantenha as condições de aquisição de imagens consistentes para que esse valor possa ser usado como um marcador confiável da qualidade da superfície e da densidade da sonda (Figura 3C).
   nota: Quantificar o número de fitas de DNA por nanopartícula de ouro e o número de nanopartículas de ouro por μm² nas primeiras vezes de preparação da superfície de acordo com a literatura, o que pode ser usado como outro marcador confiável da qualidade da superfície.
3. Coloque ~ 4 x 10⁴ - 10 x 10⁴ células em cada lamínula funcionalizada da sonda de tensão de DNA e permita que elas se prendam e se espalhem por ~ 15 min em temperatura ambiente.
4. À medida que as células são colocadas nas sondas de tensão do gancho de DNA e começam a se espalhar, obtenha imagens dos sinais de fluorescência que são gerados no canal Cy3B com a objetiva de 100x (Figura 2I).
5. Depois que as células começarem a produzir sinal de tensão em tempo real na superfície da sonda de tensão em grampo de DNA no canal Cy3B, adquira imagens nos canais Cy3B e Atto647N (a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) oferece melhor relação sinal-ruído do que a epifluorescência). Posteriormente, adicione a fita Atto647N às câmaras de imagem a uma concentração final de 200 nM para hibridização mecanicamente seletiva.
6. Após 10 minutos de incubação, remova rápida e suavemente o tampão contendo o fio de travamento fluorescente Atto647N e substitua-o por sais balanceados de Hank frescos. Imagem nos canais Cy3B e Atto647N novamente e determine o coeficiente de correlação de Pearson com o software Fiji.
7. No momento de interesse para a investigação, introduza uma fita de bloqueio não fluorescente nas células da câmara de imagem para armazenar o sinal de tensão. Preparar o fio bloqueado (100 μM) e adicionar às células numa concentração final de 1 μM. Pipetar suavemente para misturar. A duração do bloqueio pode variar, mas 10 min é o tempo recomendado.
8. Adquira filmes de lapso de tempo ou imagens de ponto final em epifluorescência para mapeamento qualitativo de tensão e análise quantitativa, conforme necessário (Figura 2J e Figura 4).
   nota: Se a medição de tensão em vários pontos de tempo for desejada, inicie o apagamento dos sinais de tensão armazenados pela adição de uma fita de desbloqueio. Para evitar o enxágue excessivo, uma concentração final mais alta da fita de desbloqueio a 2 μM é usada para iniciar uma reação de deslocamento da fita mediada pelo apoio do pé com a fita de travamento por 3 min, que apaga os sinais armazenados ( Figura 2J ). Enxágue suavemente o excesso de oligonucleotídeos com HBSS. A superfície da sonda de tensão em grampo de DNA e as células estão prontas para outra rodada de armazenamento e mapeamento de tensão. O desbloqueio de sinais de tensão não é necessário se apenas um ponto no tempo for de interesse no estudo.

Resultados

Figura 1: Exemplos de preparação de oligonucleotídeos.(A) cromatograma HPLC de purificação da fita ligante Cy3B; (B) Espectros MALDI-TOF-MS do produto; (C) Tabela da massa calculada e picos m/z encontrados do material de partida e do oligonucleotídeo marcado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido 3-hidroxipicolínico (3-HPA)	sigma	Rolamento 56197	Matriz Maldi-TOF-MS
mPEG-SC	Biochempeg	MF001023-2K	Preparação de superfície
(3-aminopropil)trietoxissilano	Acros	AC430941000	Preparação de superfície
10x tampão de lise de glóbulos vermelhos	Biolenda	00-4333-57	buffer
Nanopartículas de ouro de 8,8 nm, ácido tânico	Nanocomposix	Pedido personalizado	Preparação de superfície
Éster de Atto647N NHS	sigma	18373-1MG-F	Fluoróforo, preparação de oligo
Câmara de células Attofluor, para microscopia	Thermo Fisher Científico	Rolamento A7816	imagiologia
Seringas BD apenas com Luer-Lok	Biociência BD	309657	Células
CD3e anti-camundongo biotinilado	eBiociência	13-0031-82	Anticorpo/ligante
Ovalbumina pMHC biotinilada (SIINFEKL)	Instalação central de tetrâmero do NIH na Emory University	NA	Anticorpo/ligante
Albumina de soro bovino	sigma	735078001	Bloquear interações não específicas
Filtros de células	Biologix	15-1100	Células
Mini-Rack de Lamínula, teflon	Thermo Fisher Científico	C14784	Preparação de superfície
Éster de Cy3B NHS	GE Saúde	PA63101	Fluoróforo, preparação de oligo
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)	Corning	21-031-CM	buffer
etanol	sigma	459836	Preparação de superfície
Sais balanceados de Hank (HBSS)	sigma	H8264	buffer
Peróxido de hidrogénio	sigma	H1009	Preparação de superfície
LA-PEG-SC	Biochempeg	HE039023-3,4 mil	Preparação de superfície
Kit de inicialização Midi MACS (LS)	Miltenyi Biotec	130-042-301	Células
Kit de isolamento de células T CD8 + de camundongo	Miltenyi Biotec	130-104-075	Células
Dispositivos centrífugos Nanosep MF	Laboratório Pall	ODM02C35	Preparação de oligo
Nº 2 lamínulas de vidro redondas	VWR	Rolamento 48382-085	Preparação de superfície
NTA-SAM	Dojindo Tecnologias Moleculares	N475-10	Preparação de superfície
Gel P2	Bio-rad	1504118	Preparação de oligo
ácido sulfúrico	Corporação EMD Millipore	SX1244-6	Preparação de superfície
Acetato de Sulfo-NHS	Thermo Fisher Científico	Rolamento 26777	Preparação de superfície
equipamento
Coluna de oligonucleotídeo C18 Agilent AdvanceBio, 4,6 x 150 mm, 2,7 μm	Rolamento 653950-702		Preparação de oligonucleotídeos
Sistema de purificação de água Barnstead Nanopure	Thermo Fisher		Água
CFI Apo 100× NA 1.49 objetivo	Nikon		microscopia
Cubo Cy5	Chroma		microscopia
Dispositivo acoplado de carga multiplicadora de elétrons (EMCCD)	Fotometria		microscopia
Cromatografia líquida de alta eficiência	Agilent 1100		Preparação de oligonucleotídeos
Fonte de epifluorescência de luz intensiva	Nikon		microscopia
Espectrômetro de massa de tempo de voo de ionização/dessorção a laser assistido por matriz (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		Preparação de oligonucleotídeos
Espectrofotômetro UV-Vis Nanodrop 2000	Thermo Fisher		Preparação de oligonucleotídeos
Microscópio invertido Nikon Eclipse Ti	Nikon		microscopia
Sistema de foco perfeito da Nikon	Nikon		microscopia
Software NIS Elements	Nikon		microscopia
Quad band TIRF 405/488/561/647 cubo	Chroma		microscopia
Cubo RICM	Chroma		microscopia
Lançador TIRF com 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW) e 640 nm	coerente		microscopia
Cubo TRITC	Chroma		microscopia
Nome oligo	Modificação de 5 '/ modificação de 3'	Sequência (5' a 3')	usar
Fio de travamento de amina de 15mer	Modificação de 5 ': sem modificação Modificação de 3': /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	Bloqueio do sinal de tensão em tempo real
Fio de travamento Atto647N de 15mer	Modificação de 5': Atto647N Modificação de 3': /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	Bloqueio do sinal de tensão em tempo real
Fio de travamento não fluorescente de 15mer	Modificação de 5 ': sem modificação 3' modificação: nenhuma modificação	UM AAA AAC ATT TAT AC	Bloqueio de sinal de tensão em tempo real para análise quantitativa
4,7 pN fio grampo de cabelo	Modificação de 5 ': sem modificação 3' modificação: nenhuma modificação	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC	Sonda Hairpin
Fita ligante de amina	Modificação de 5': /5AmMC6/ 3' modificação: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Sonda Hairpin
Cordão de ancoragem BHQ2	Modificação de 5': /5ThiolMC6-D/ Modificação de 3': /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	Sonda Hairpin
Fita de ligante Cy3B	5' modificação: Cy3B 3' modificação: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Sonda Hairpin
Desbloqueando o fio	Modificação de 5 ': sem modificação 3' modificação: nenhuma modificação	TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	Desbloqueando o sinal de tensão acumulada