Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de estoques e armazenamento CFSE
- Preparar uma reserva de 5 mM de éster succinimidílico de diacetato de 5 e 6-carboxifluoresceína (CFSE) em dimetilsulfóxido. Vórtice. Dispense alíquotas de 100 μl em microtubos estéreis com tampa de rosca de 0,5 ml. Armazenar alíquotas a -80 °C.
2. Ratos
- Utilizar ratinhos machos ou fêmeas consanguíneos com idades compreendidas entre as 8 e as 12 semanas. Animais pareados por sexo e idade são preferidos. Certifique-se de que as licenças éticas animais necessárias estejam em vigor antes do início dos experimentos.
3. Imobilização de Animais com Anestesia com Gás Isoflurano
- Carregue a unidade de anestesia com isoflurano. Encha a seringa de vidro estanque a gás de 10 ml com isoflurano. Evite introduzir bolhas de ar. Conecte a seringa e a entrada de líquido com o tubo fornecido e mova o empurrador para frente até que o líquido no tubo de conexão esteja visivelmente prestes a entrar no vaporizador.
nota: Não armazene o isoflurano na seringa quando não estiver em uso.
- Anestesiar os animais com isoflurano na câmara de indução, com fluxo aéreo mantido em torno de 400 - 500 ml/min e concentração de isoflurano em 3,5%.
nota: A unidade não funcionará sem fluxo de ar.
- Quando os animais estiverem dormindo, gire a torneira da unidade de anestesia para direcionar o gás isoflurano para a peça da máscara. Verifique se a peça da máscara está intacta para evitar vazamento de gás. O fluxo de ar pode ser mantido em 400 ml/min, alternativamente diminuído para 200 ml/min. Reduzir a concentração de isoflurano para 2,6%.
nota: O efeito anestésico pode ser aumentado e/ou diminuído ajustando a taxa de fluxo.
4. Injeções e recuperação de BCG
- Confirme visualmente e realize testes como o teste do reflexo de pinça do dedo do pé para verificar se os camundongos estão imobilizados/dormindo na peça da máscara de isoflurano antes de realizar as injeções.
- Inocular na pata traseira, 1 x 106 unidades formadoras de colônias de Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) em 30 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS) usando uma seringa equipada com uma agulha de 29 G x 1/2 polegada.
nota: A geração de estoques de micobactérias é brevemente descrita na descrição original deste procedimento e em detalhes substanciais em outros lugares. O BCG também está prontamente disponível em fontes comerciais. Os autores recomendam que o BCG seja sonicado por pulso ou passado por uma seringa para interromper os aglomerados antes de sua inoculação em camundongos. O BCG é reiterado aqui como um estímulo microbiano devido ao seu emprego na descrição original deste protocolo 3, mas os autores certamente encorajam o teste de outros estímulos microbianos.
- Execute o mesmo procedimento descrito acima para a injeção de PBS em camundongos de controle.
- Monitore os animais após as injeções para confirmar se a recuperação da anestesia foi bem-sucedida e se os animais podem se apoiar na pata traseira injetada.
5. Injeções CFSE
- Preparação de CFSE para injeções
- Descongele um frasco para injetáveis de solução estoque de CFSE a 5 mM a -80 °C. Dilua o CFSE 10 vezes em PBS. Ressuspenda cuidadosamente a solução antes de encher a seringa em preparação para a injeção.
- Injeção e recuperação de CFSE
- Repita o procedimento para anestesiar animais na seção 3. Injetar 20 μl de CFSE 0,5 mM na pata traseira que recebeu anteriormente BCG ou PBS.
nota: A injeção de CFSE deve ser realizada no dia anterior (24 horas) à data planejada para o sacrifício.
6. Remoção Cirúrgica do Linfonodo Poplíteo (pLN)
NOTA: O uso de instrumentos cirúrgicos esterilizados e sua descontaminação repetida em etanol a 70% são incentivados ao longo desta etapa.
- Eutanásia dos ratos. Pulverize o animal com etanol 70%. Prenda o animal em decúbito dorsal, em uma prancha de dissecação.
nota: Os autores podem recomendar a eutanásia por meio da luxação cervical.
- Faça cuidadosamente uma incisão vertical na coxa traseira. Limpe o músculo e a gordura usando tesouras e pinças para expor e consequentemente extirpar o pLN localizado profundamente na bolsa de gordura, na cavidade do joelho.
- Transfira o pLN para 0,5 ml de PBS estéril, no gelo.
7. Geração de suspensão de célula única a partir de pLN
- Homogeneizar o pLN através de um filtro de células de 70 mícrons colocado em uma placa de 6 poços contendo 5 ml de PBS ou tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) (PBS contendo 2% de soro fetal de bezerro (FCS), 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 1 mM de azida sódica). Homogeneizar através do filtro usando a extremidade traseira de uma seringa de 3 ml.
nota: A azida sódica é tóxica e deve ser manuseada com cautela.
- Lave o filtro com mais 5 ml de tampão PBS ou FACS, colete o material em um tubo de 15 ml e pelete as células a 277 x g (1.200 rpm, R = 172 mm) por 5 min, 4 ° C. Alternativamente, homogeneizar pLNs diretamente em tubos de microcentrífuga usando homogeneizadores de polipropileno.
- Com base no tamanho do pellet, ressuspenda a suspensão pLN em um volume apropriado de tampão PBS ou FACS, por exemplo, 200 - 1.000 μl. Use uma câmara de contagem para quantificar o número total de células obtido de cada suspensão LN. Use azul de tripano para excluir células mortas / moribundas.
8. Coloração celular e citometria de fluxo
- Transferir 1 - 10 x 106 células para tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 ml. Lavar com tampão FACS e pellet por centrifugação a 277 x g (1.200 rpm, R = 172 mm) durante 5 min, 4 °C.
- Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 50 - 100 μl de coquetel de anticorpos (ver Marcadores de células dendríticas [DC] usados para coloração de superfície, Tabela de Materiais) contendo 0,5 - 1 μg de anti-camundongo CD16 / CD32 (para bloquear interações mediadas por Fc inespecíficas) em tampão FACS por 30 - 45 min, no gelo. Proteja as amostras da luz.
- Após a incubação, lave as células com tampão FACS e pellet por centrifugação a 277 x g (1.200 rpm, R = 172 mm) por 5 min, 4 ° C.
- Ressuspenda as células em 50 - 100 μl de tampão FACS. Adquira dados em um citômetro de fluxo.
