Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. A. fumigatus Cultura e Condições
- Prepare o meio de ágar glicose mínimo conforme descrito.
- Ajuste o meio para pH 6.5 usando hidróxido de sódio (NaOH) 1 M e autoclave a 120 ° C por 20 min.
- Deixar arrefecer até 65 °C.
- Trabalhando em uma capela de fluxo estéril, despeje 30 mL de meio resfriado em um frasco T75 e deixe-o esfriar com o gargalo do frasco apoiado em uma pipeta de 25 mL para criar uma inclinação de ágar.
- Riscar a estirpe dsRed Af293-Aspergillus fumigatus no ágar e incubar durante 7 dias a 37 °C + 5% de dióxido de carbono (CO2). Dois frascos produzirão aproximadamente 109 conídios em 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pré-biotinilação.
2. Rotulagem e preparação de A. fumigatus
NOTA: Ao realizar este ensaio pela primeira vez, prepare a cepa parental Af293-A. fumigatus. Colher amostras de ambas as estirpes em tubos de microcentrífuga e rotular apenas uma de cada estirpe, conforme descrito abaixo. Isso permitirá que se tenha conídios de controle sem cor e conídios com uma única cor, seja dsRed ou Alexa Fluor 633 (AF633), para testar a configuração e o equipamento.
- Colha os conídios de A. fumigatus imergindo a cultura com 30 mL de PBS + 0,05% de Tween-80. Filtre a suspensão resultante através de um filtro de células de 40 μm em um tubo de 50 mL para remover fragmentos de hifas.
- Centrifugue a 805 x g por 10 min, remova o sobrenadante e lave uma vez em 20 mL de PBS estéril. Conídios de piscina de duas placas da mesma cepa durante a etapa de lavagem.
- Após a etapa de lavagem, ressuspenda o pellet em 5 mL de PBS e transfira alíquotas de 1 mL de suspensão de conídios para tubos de microcentrífuga. 1 mL de suspensão de cada cepa geralmente é suficiente para imagens de células vivas. Embrulhar as restantes alíquotas em papel alumínio e conservar a 4 °C.
- Centrifugue alíquotas de suspensão de conídios a 9.300 x g por 10 min em temperatura ambiente e remova cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda o pellet de conídios em 1 mL de bicarbonato de sódio 0,05 M (NaHCO3) pH 8,3.
- Preparar 10 mg de biotina/200 μL de solução de reserva de dimetilsulfóxido (DMSO) reconstituindo 25 mg de biotina em 500 μL de DMSO. Adicione 10 μL de solução estoque de biotina / DMSO ao tubo de microcentrífuga, cubra-o com papel alumínio e incube por 2 h em um balancim a 4 ° C.
- Alíquota do restante da solução-mãe de biotina/DMSO e congelar a -20 °C para utilização em experiências subsequentes.
- Centrifugue por 10 min a 9.300 x g e remova cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda o pellet de conídios em 1 mL de cloridrato de Tris (hidroximetil) aminometano (Tris-HCl) 100 mM pH 8,0 por 1 h para desativar a biotina flutuante.
- Centrifugue por 10 min a 9.300 x g e remova cuidadosamente o sobrenadante. Lave o pellet duas vezes com 1 mL de PBS estéril e ressuspenda o pellet em 1 mL de PBS.
- Dissolva 1 mg de estreptavidina-AF633 em 0,5 mL de PBS para fazer uma solução estoque de 2 mg / mL. Adicione 10 μL de 2 mg / mL de estreptavidina-AF633 por 1 mL de suspensão de conídios e incube por 40 min em temperatura ambiente em um balancim coberto com papel alumínio. A Streptavidin-AF633 restante pode ser congelada em alíquotas para uso em experimentos subsequentes.
- Centrifugue por 10 min a 9.300 x g e remova cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda o pellet de conídios em 1 mL de PBS e conte os conídios usando um hemocitômetro em uma diluição de 1:1.000 (1:100 e depois 1:10). Ajustar a concentração de conídios para 3,6 x 106/ml com meios independentes de CO2, embrulhar em papel alumínio e conservar a 4 °C.
nota: Os conídios agora são marcados com AF633 e serão chamados de conídios FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE).
- Opcional: Se for necessária estimulação com conídios inchados, após a contagem dos conídios (etapa 2.9), dilua os conídios a 7,2 x 106 / mL em meio à base de nitrogênio de levedura (YNB) e adicione 500 μL de suspensão de conídios a 4,5 mL de meio YNB em um frasco Erlenmeyer autoclavado de 50 mL. Cobrir e colocar o balão numa incubadora agitada (200 rpm a 37 °C) durante 6 h.
- Transfira o meio para um tubo de 15 mL. Centrifugue a 805 x g por 10 min em temperatura ambiente e lave uma vez em PBS. Centrifugue novamente e ressuspenda o pellet em meio independente de 1 mL CO2, dando 3,6 x 106 conídios / mL.
NOTA: Os conídios freqüentemente se aglomeram depois de ficarem inchados, dificultando a contagem precisa, é aconselhável calcular com os números contados de conídios em repouso usados.
3. Isolamento de neutrófilos e monócitos humanos
- Retire 20 mL de sangue venoso de voluntários saudáveis em dois tubos de sangue de 10 mL contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Para cada doador separadamente, despeje 20 mL de sangue em um tubo de 50 mL e dilua com 15 mL de PBS.
- Cubra o sangue com 15 mL de uma solução de isolamento de linfócitos (densidade 1,077 g / mL) com uma seringa e agulha de ferro. Coloque a agulha no fundo do tubo e force suavemente a solução de isolamento de linfócitos para fora. Centrifugue a 630 x g por 20 min sem freio e baixa aceleração.
- Prepare o PBS, gelado no gelo.
nota: Os passos 3.4 e 3.5 devem ser seguidos simultaneamente para gerar monócitos (3.4) e neutrófilos (3.5).
- Usando um pastete, colha a camada de células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Esta é a camada no centro entre o soro amarelo (superior) e a camada transparente da solução de isolamento de linfócitos (inferior) e transfere para um novo tubo de 50 mL.
- Encha o tubo com PBMC até 50 mL com PBS frio e centrifugue a 582 x g por 10 min. Remova o sobrenadante e lave duas vezes com PBS frio e ressuspenda em 1 mL de PBS por 20 mL de sangue de doador usado inicialmente.
- Faça diluições 1:10 para contagem adicionando 20 μL da suspensão celular a 160 μL de PBS e 20 μL de azul de tripano. Conte as células com um hemocitômetro.
- Prepare uma solução tampão adicionando 26 mL de soro fetal de bezerro inativado pelo calor (FCS) e 2,1 mL de EDTA 0,5 M a 500 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS). Centrifugue as células por 10 min a 515 x g e ressuspenda em 40 μL de solução tampão por 1 x 107 células.
- Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL e adicione 10 μL de microesferas de CD14 por 1 x 107 células, misture bem e incube por 15 min a 4 ° C, certificando-se de misturar os tubos a cada 5 min.
- Lave as células adicionando 1 mL de solução tampão por 1 x 107 células e centrifugue a 515 x g por 10 min.
- Aspirar completamente o sobrenadante e ressuspender até 1 x 108 células em 500 μl de solução tampão.
- Coloque 1 coluna por amostra em um separador magnético de acordo com as instruções do fabricante. Primeiro, lave a coluna uma vez com 500 μL de solução tampão.
- Pipetar os 500 μl de suspensão celular através da coluna, esperar que a coluna seque e depois lavar repetindo três vezes com solução tampão.
- Coloque um novo tubo de 15 mL embaixo da coluna e retire a coluna do separador magnético. Em seguida, lave as células da coluna para o tubo com 1 mL de solução tampão.
- Adicione 4 mL de solução tampão e centrifugue a 515 x g por 10 min e, em seguida, ressuspenda em 1 mL de meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
- Faça diluições 1:10 para contagem adicionando 20 μL da suspensão celular a 160 μL de PBS e 20 μL de azul de tripano. Conte as células com um hemocitômetro.
- Ajuste a concentração da célula para 6 x 105/mL com RPMI e semeie 200 μL em uma placa de imagem à base de vidro de 35 mm. Incubar durante a noite a 37 °C com 5% de CO2.
- No dia seguinte, antes da imagem, remova o RPMI e adicione 200 μL de meio independente de CO2.
nota: Esses monócitos também podem ser diferenciados em vários subconjuntos de macrófagos antes da imagem. Se esta é uma técnica a ser explorada, um excelente ponto de partida é um artigo recente de Ohradanova-Repic et al.
- Após a colheita da camada de PBMC, remova todo o soro e a maior parte da solução de isolamento de linfócitos, mas tome cuidado para não remover a pequena faixa branca em cima do pellet vermelho, pois ela conterá a maioria dos neutrófilos.
- Prepare um estoque tampão de lise hipotônica 10x adicionando 83 g de cloreto de amônio (NH4Cl) e 10 g de bicarbonato de potássio (KHCO3) em 1 L de água estéril. Conservar a 4 °C.
- Dilua este caldo 10x com água estéril e adicione-o aos tubos. Em seguida, inverta cuidadosamente 3 vezes e incube em gelo por 15 min.
- Centrifugue a 394 x g por 10 min e ressuspenda em tampão de lise hipotônica por 10 min em gelo.
- Centrifugue a 394 x g e lave duas vezes com PBS frio. Ressuspender em 1 mL de meio independente de CO2 por doador.
- Faça diluições 1:10 para contagem adicionando 20 μL da suspensão celular a 160 μL de PBS e 20 μL de azul de tripano. Conte as células com um hemocitômetro.
- Para microscopia, adicione 200 μL da mesma suspensão celular a uma placa de imagem à base de vidro de 35 mm.
NOTA: A imagem de neutrófilos ou citometria de fluxo deve ser iniciada imediatamente devido à sua propensão a sofrer apoptose se não for estimulada. Se isso não for possível, os neutrófilos devem ser mantidos no gelo e usados o mais rápido possível (no mesmo dia).
4. Microscopia de vídeo de célula viva
NOTA: A escolha do microscópio dependerá do que está disponível localmente, mas a configuração do microscópio precisará incluir um estágio invertido, uma câmara ambiental aquecida a 37 °C e filtros de excitação/emissão apropriados para dsRed (532/561 nm) e AF633 (633 nm). Os conídios FLARE não funcionam com o laser de 488 nm em vez do laser de 532/561 nm para dsRed. Ao realizar este experimento pela primeira vez, use os conídios de controle sem cor e cor única para testar a fluorescência de fundo e o sangramento entre os canais dsRed e AF633.
- Ligue o aquecedor do microscópio antes do experimento e dê tempo suficiente para que a câmara de controle ambiental aqueça a 37 °C. O tempo necessário para a temperatura da câmara se estabilizar varia de acordo com as diferentes configurações do microscópio.
- Ligue o microscópio e o computador e carregue o software de imagem. Monte a placa de imagem no microscópio stage e ajuste o foco para encontrar os neutrófilos ou monócitos humanos.
- Para dsRed e AF633, defina a potência do laser para 10% e o tempo de exposição para 1 s nas configurações de aquisição.
- Remova a lâmina de imagem e adicione 100 μL de suspensão de conídios FLARE de 3 x 106/mL aos poços apropriados (volume total de 300 μL/poço). Registre o tempo em que os conídios FLARE são adicionados ao prato.
- Retorne o slide para o palco e ajuste a sensibilidade da câmera para dsRed e AF633 para ver claramente os conídios, mas não superexpor a imagem. Configure uma lista de pontos de estágio se a aquisição de vários pontos for necessária.
- Inicie a geração de imagens quando todos os pontos estiverem em foco, os canais forem otimizados e o tempo e a duração do ciclo forem definidos. O tempo de ciclo e a duração da imagem dependem da questão experimental. O objetivo é manter o tempo de ciclo o mais curto possível (≤2 min) com 1 min, permitindo uma análise aprofundada da dinâmica de absorção.
