Utilizando bicamadas lipídicas suportadas por grânulos para investigar a saída sináptica das células T

Resumo

Fonte: Céspedes, P. F., et al. Preparação de Bicamadas Lipídicas Suportadas por Grânulos para Estudar a Saída Particulada de Sinapses Imunes de Células T. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo ilustra a reconstituição de células apresentadoras de antígenos sintéticos por meio de bicamadas lipídicas suportadas por grânulos e sua aplicação na avaliação da saída sináptica gerada por células T ativadas.

Protocolo

1. Calibrações de densidade de proteínas em BSLBs (bicamadas lipídicas suportadas por contas)

1. Antes de tomar as esferas de sílica não funcionalizadas de 5,00 ±0,05 μm de diâmetro, misture bem a solução de estoque e ressuspenda quaisquer grandes aglomerados de esferas sedimentadas no fundo dos frascos.
   NOTA: As esferas de sílica tendem a sedimentar rapidamente, o que pode levar a erros de contagem. Misture vigorosamente pipetando para cima e para baixo metade do volume máximo de uma micropipeta P1000.
2. Diluir 1 μL de solução de grânulos em 1.000 μL de PBS, contar os grânulos usando uma câmara de hemocitômetro e calcular sua concentração por mL.
   nota: A coloração com azul de tripano não é necessária para visualizar contas de sílica.
3. Calcular o volume de esferas de sílica necessário para 5 × 10⁵ BSLB finais por ponto da titulação.
4. Transfira o volume necessário de esferas de sílica para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL.
5. Lave os grânulos de sílica três vezes com 1 mL de PBS estéril e centrifugue os grânulos por 15 s em uma microcentrífuga de bancada em RT (em rpm fixa).
   NOTA: Ao remover a solução de lavagem, evite mexer no grânulo do grânulo. Uma pequena coluna tampão não afetará a distribuição dos lipossomas que compõem a mistura principal de lipossomas, pois estes também estão em PBS.
6. Preparar três volumes da mistura principal de lipossomas para montar o BSLB nos grânulos de sílica lavados (por exemplo, se o volume total inicial dos grânulos de sílica for de 20 μL, preparar um mínimo de 60 μL da mistura principal de lipossomas).
7. Para titulações de % mol de PE de tampa de biotinil
   1. Prepare as master mixes lipídicas contendo diluições de 5 vezes de Biotinyl Cap PE.
      1. Dilua o 0,4 mM Biotinyl Cap PE mol% em uma matriz 100% DOPC.
      2. Misture cada ponto de titulação de PE mol% de Biotinyl Cap em uma proporção de 1:1 (vol: vol) com uma solução de 0,4 mM 25% DGS-NTA (Ni) de modo que um final de 12,5% mol de lipídios contendo Ni esteja presente em todas as titulações.
         nota: Os 12,5 mol% (vol:vol%) de lipídios contendo Ni representam a composição lipídica mista de BSLBs nos quais as proteínas marcadas com His também podem ser testadas em calibrações paralelas. Por exemplo, uma vez que todos os estoques de lipossomas são preparados na mesma concentração molar, para atingir a mistura alvo de % mol em 200 μL de mistura final de lipossomas, basta misturar 100 μL de 25 mol% de DGS-NTA contendo Ni com 100 μL de 100% molar DOPC.
   2. Transfira 5 × 10⁵ esferas de sílica lavadas para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, de modo que um ponto de titulação de PE mol% de tampa de biotinil seja montado por tubo.
   3. Adicione as misturas master de titulação de PE mol% Biotinyl Cap às esferas de sílica lavadas e misture suavemente pipetando para cima e para baixo metade do volume total. Evite formar bolhas, que em excesso destroem a bicamada lipídica.
   4. Adicione gás argônio (ou nitrogênio) no tubo que contém os BSLBs agora em formação para deslocar o ar e proteger os lipídios da oxidação durante a mistura.
   5. Adicione argônio aos estoques lipídicos de 0,4 mM antes do armazenamento e manipule usando uma técnica estéril.
      nota: Conecte um pequeno tubo ao cilindro de gás argônio/nitrogênio. Antes de adicionar gás aos tubos, ajuste o regulador do cilindro de gás para que a pressão não seja superior a 2 psi. Conecte uma ponta de pipeta estéril ao tubo de saída para direcionar o fluxo de gás dentro do estoque de lipossomas por 5 segundos e feche rapidamente a tampa. No caso de estoques lipídicos, feche a tampa do tubo com filme de parafina antes de armazená-lo a 4 °C.
   6. Mova os BSLBs para um misturador de laboratório vertical de ângulo variável (consulte a Tabela de Materiais) e misture por 30 min em RT usando uma mistura orbital de 10 rpm.
      nota: Esta etapa evitará a sedimentação de grânulos durante a formação da bicamada lipídica suportada.
   7. Gire os grânulos centrifugando por 15 s em RT em uma minicentrífuga de bancada e, em seguida, lave três vezes com 1 mL de HBS / HSA (BSA) para remover o excesso de lipossomas.
   8. Bloqueie os BSLBs formados adicionando 1 mL de caseína a 5% ou BSA a 5% contendo 100 μM de NiSO₄ para saturar os locais NTA e estreptavidina 200 nM para revestir uniformemente todos os locais de ancoragem de biotina nos BSLBs. Misturar delicadamente, pipetando para cima e para baixo metade do volume total e incubar na batedeira vertical durante um máximo de 20 minutos a RT e 10 rpm.
   9. Gire os BSLBs centrifugando por 15 s em RT em uma minicentrífuga de bancada e, em seguida, lave três vezes com 1 mL de tampão HBS/HSA (BSA).
      nota: Mantenha as esferas lavadas verticalmente com um pequeno volume de tampão de lavagem cobrindo os BSLBs. Evite a desidratação dos BSLBs, pois o ar destruirá a bicamada lipídica.
8. Para a titulação de proteínas marcadas com His em 12,5 mol% de BSLBs contendo DGS-(Ni) NTA
   1. Preparar três volumes de master mix de lipossomas contendo 12,5 mol% finais de DGS-NTA(Ni).
   2. Use a mistura principal de lipossomas para ressuspender as esferas de sílica lavadas e misture suavemente pipetando para cima e para baixo metade do volume total. Evite formar bolhas, que danificam em excesso a bicamada lipídica.
   3. Adicione gás argônio (ou nitrogênio) no tubo que contém os BSLBs agora em formação para deslocar o ar e proteger os lipídios da oxidação durante a mistura.
   4. Adicione argônio aos estoques de lipídios de 0,4 mM antes do armazenamento e manipule usando uma técnica estéril.
   5. Mova os BSLBs para o misturador vertical e misture por 30 min em RT usando a mistura orbital a 10 rpm.
   6. Gire os grânulos centrifugando por 15 s em RT em uma minicentrífuga de bancada e, em seguida, lave três vezes com 1 mL de HBS / HSA (BSA) para remover o excesso de lipossomas.
   7. Bloqueie os BSLBs formados adicionando 1 mL de caseína a 5% (ou 5% de BSA) contendo 100 μM de NiSO4 para saturar os locais NTA nos BSLBs. Misture suavemente e incube no misturador vertical por não mais de 20 min em RT e 10 rpm.
   8. Lave três vezes usando HBS/HSA (BSA) para remover o excesso de solução de bloqueio.
   9. Em uma nova placa de 96 poços com fundo em U, prepare diluições seriais de 2 vezes das proteínas.
      1. Prepare uma concentração inicial de 100 nM para a proteína de interesse em um volume total de 200 μL de tampão HBS/HSA (BSA), distribua 100 μL desta solução na primeira coluna e os 100 μL restantes no topo da coluna #2 contendo 100 μL de tampão HBS/HSA (BSA).
      2. Continue transferindo em série 100 μL da coluna #2 para a coluna #3 e repita conforme necessário para cobrir todos os pontos de titulação. Deixar a última coluna da série sem proteína, uma vez que esta será utilizada como referência em branco para a quantificação.
   10. Ressuspenda os BSLB preparados num volume tal que 5 × 10⁵ BSLB estejam contidos em 100 μL de tampão HBS/HSA (BSA).
   11. Transferir 100 μL da suspensão BSLB para poços de uma segunda placa de 96 poços com fundo em U, de modo que cada poço receba 5 × 10⁵ BSLBs.
   12. Girar a segunda placa contendo BSLBs por 2 min a 300 × g e RT e descartar o sobrenadante.
   13. Transfira os volumes de 100 μL da placa de titulação de proteínas para a placa que contém os BSLBs sedimentados. Misture suavemente, evite a geração excessiva de bolhas durante a pipetagem e incube por 30 min em RT e 1.000 rpm usando um agitador de placas. Proteja da luz com papel alumínio.
   14. Lave a placa três vezes com tampão HBS/HSA (BSA) usando etapas de sedimentação de 300 × g por 2 min em RT.
   15. Se a proteína recombinante usada na calibração estiver diretamente conjugada com fluorocromos e tiver valores F/P conhecidos.
   16. Se a proteína recombinante usada na calibração não for marcada ou conjugada a fluorocromos ou nenhum padrão de esferas MESF estiver disponível, use anticorpos conjugados Alexa Fluor 488 ou 647 com valores F/P conhecidos para corar o BSLB revestido com proteína.
   17. Corar com concentrações saturantes de anticorpos de quantificação.
       NOTA: Dependendo do nível de expressão alvo, eles variam entre 5 e 10 μg/mL.
   18. Manchar por 30 min em RT e 1.000 rpm usando um agitador de placas. Proteja da luz usando papel alumínio.
   19. Lave duas vezes com tampão HBS/HSA (BSA) e uma vez com PBS usando etapas de sedimentação de 300 × g por 2 min em RT.
       nota: Use PBS, pH 7,4 para ressuspender os BSLBs lavados antes da aquisição. Não use tampões contendo proteínas, pois isso leva à formação de bolhas durante a mistura automática de amostras com amostradores de alto rendimento.
   20. Adquira os padrões MESF, certificando-se de que os picos mais brilhantes permaneçam na faixa de detecção linear para o detector de quantificação (canal), conforme mostrado na Figura 1B (vii).
   21. Adquira as amostras manualmente ou usando HTS. Se estiver usando o último, ressuspenda BSLBs em 100 μL de PBS e adquira 80 μL usando uma taxa de fluxo entre 2.5 e 3.0 μL / s, um volume de mistura de 100 μL (ou 50% do volume total se o volume de ressuspensão for menor), uma velocidade de mistura de 150 μL / s e cinco misturas para garantir que os BSLBs sejam monodispersos.
   22. Exporte os arquivos FCS.
   23. Concentre-se em eventos únicos para as análises (Figura 2A), pois duplicatas ou trigêmeos introduzirão erros na determinação. Use a identificação aninhada de eventos únicos, conforme indicado na etapa 1.2.3 do protocolo.
   24. Meça o IFM de cada fração MESF (1-4) e subtraia o IFM dos grânulos em branco para extrair os IFM corrigidos (IMFc).
   25. Realize uma análise de regressão linear para extrair a inclinação (b) do MESF sobre o cMFI calculado para os padrões MESF.
   26. Extrair a IFM de cada ponto de titulação e subtrair a IFM das esferas sem proteína para obter as IMFc.
   27. Divida os cMFIs com a inclinação calculada para extrair o MESF ligado aos BSLBs para cada ponto de titulação.
   28. Divida o MESF ligado a BSLBs pelo valor F/P do anticorpo de quantificação para extrair o número médio de moléculas ligadas por BSLB.
   29. Usando o diâmetro dos BSLBs (5,00 ± 0,05 μm), extraia a área da superfície do grânulo (SA = 4pr2) para calcular as densidades finais de proteína (molec./μm²) por ponto de titulação (concentração de proteína).
   30. Realizar uma nova análise de regressão da concentração de proteína sobre a densidade de proteína para calcular a inclinação (b) da linha de melhor ajuste.
       nota: A concentração de 12,5 mol% de DGS-NTA(Ni) confere uma capacidade máxima de ancoragem de aproximadamente 10.000 molec./μm2 10 sem induzir a ativação inespecífica de células T ou afetar a mobilidade lateral dos SLBs.

2. Realizando experimentos de transferência sináptica entre células T e BSLBs

1. Antes de executar o experimento de transferência sináptica
   1. Adquira BSLBs não fluorescentes, BSLBs com lipídios fluorescentes, células não coradas (ou contas de compensação; consulte a Tabela de Materiais) e células coradas de cor única (ou contas de compensação) para identificar as interações do espectro de fluorescência do instrumento. Concentre-se nos detectores com alto espalhamento de transbordamento para redesenhar o painel policromático, aumentar a sensibilidade e reduzir o erro de medição em detectores críticos.
   2. Titular os anticorpos de detecção para encontrar a concentração ideal, permitindo a detecção de eventos positivos sem comprometer a detecção de negativos.
      nota: Repita esta etapa sempre que houver uma alteração no lote de anticorpos, pois os valores de F/P e o brilho variam de lote para lote.
   3. Opcional: Otimize as tensões PMT adquirindo a amostra em diferentes faixas de tensão (ou seja, uma tensão caminha) para encontrar os PMTs que levam ao sinal ideal sobre o ruído (ou seja, separação de negativos e positivos, garantindo que o sinal da população mais brilhante permaneça na faixa linear).
2. Medição da transferência de saída de células T para BSLBs
   1. Prepare RPMI 1640 suplementado (aqui meio R10) contendo 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS), 100 μM de aminoácidos não essenciais, 10 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 100 U / ml de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina. Use o meio R10 para cultivar e expandir as células T.
   2. No dia 1, isole as células T do sangue periférico ou das câmaras do sistema de leucorredução (LRS). Use kits de isolamento e separação de células de imunodensidade (consulte a Tabela de Materiais) para o enriquecimento de células T CD4 + e CD8 + humanas.
   3. Semeie as células em uma concentração final variando entre 1,5 e 2,0 × 10⁶ células/mL, usando placas de 6 poços com não mais que 5 mL no total por poço.
   4. Ative as células T usando uma proporção de 1:1 de células T humanas (anti-CD3/anti-CD28) esferas magnéticas (consulte a Tabela de Materiais) e adicione 100 UI de IL-2 humana recombinante para apoiar a proliferação e sobrevivência celular.
   5. No dia 3, remova as esferas magnéticas ativadoras usando colunas magnéticas (consulte a Tabela de Materiais). Certifique-se de que as esferas magnéticas permaneçam presas às laterais do tubo antes de recuperar as células para etapas adicionais de lavagem.
   6. Lave as esferas magnéticas mais uma vez com 5 mL de meio R10 fresco, misture bem e coloque-as de volta no ímã. Recupere esse volume e misture-o com as células recuperadas na etapa 1.2.5.
   7. Ressuspenda as células para 1,5-2 × 10⁶ células / mL em R10 fresco contendo 100 U / mL de IL-2. Reabastecer o meio após 48 h, certificando-se de que a última adição de IL-2 seja 48 h antes do dia da experimentação (dias 7 a 14 de cultura).
   8. No dia do experimento de transferência sináptica, prepare o meio de ensaio de transferência sináptica suplementando o meio RPMI 1640 sem vermelho de fenol com 10% de FBS, 100 μM de aminoácidos não essenciais, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Não inclua IL-2 humana recombinante.
   9. Conte as células usando a coloração com azul de tripano ou a exclusão de corrente elétrica e ressuspenda-as até uma concentração final de 2,5 × 10⁶ células / mL no meio. Se for observada morte celular excessiva (>10%), remova as células mortas/moribundas usando uma mistura de polissacarídeo e diatrizoato de sódio (consulte a Tabela de Materiais) da seguinte forma:
      1. Camada de 15 mL de cultura de células em cima de 13 mL da solução de polissacarídeo-diatrizoato de sódio.
      2. Centrifugue por 1.250 × g por 20 min em RT com aceleração e desaceleração mínimas. Coletar a camada celular (nuvem) na interface entre o meio e a solução de polissacarídeo e diatrizoato de sódio.
      3. Lavar as células pelo menos duas vezes com um meio de ensaio de transferência sináptica pré-aquecido (preparado no passo 1.2.7).
      4. Conte e ressuspenda as células até uma concentração final de 2,5 × 10⁶ / mL usando um meio de ensaio de transferência sináptica. Cocultura de 100 μL desta suspensão celular com BSLBs (ver etapa 1.2.15).
   10. Calcular o número de BSLB necessários para a experiência; considerar todas as diferentes misturas principais de proteínas e titulações de antigénios a ensaiar (monómeros de peptídeos HLA/MHC biotinilados ou anti-CD3ε Fab monobiotinilados).
   11. Monte os BSLBs seguindo as mesmas etapas da seção 5 do protocolo, mas desta vez, combine todas as titulações de proteínas e lipídios necessárias para reconstituir uma membrana APC complexa (Figura 3A). Mantenha as mesmas relações vol: vol entre o volume inicial de esferas de sílica e o volume de mistura de proteínas usado durante as calibrações, bem como os tempos e temperaturas usados no carregamento de BSLBs. Por exemplo, se 0,5 μL de esferas de sílica/poço e 100 μL/poço de mistura de proteínas foram usados para a calibração inicial, mantenha proporções de 5:1.000 vol:vol para preparar os BSLBs para serem cocultivados com células T.
   12. Uma vez que os BSLBs tenham sido carregados com a mistura de proteínas de interesse, lave os BSLBs duas vezes com HBS / HSA (BSA) para remover o excesso de proteínas não ligadas. Utilizar velocidades de sedimentação de 300 × g durante 2 min à RT em cada fase de lavagem e eliminar os sobrenadantes.
   13. Ressuspender os 5 × 105 BSLBs por alvéolo em 200 μL.
   14. Transferir 100 μL por alvéolo para uma nova placa de 96 poços com fundo em U para fazer uma duplicata, de modo a que a quantidade final de BSLB por alvéolo seja de 2,5 × 10⁵.
   15. Gire os BSLBs a 300 × g por 2 min e RT e descarte o sobrenadante.
   16. Ressuspenda os BSLBs usando 100 μL de suspensão de células T; misture suavemente para evitar a formação de bolhas.
   17. Incubar as coculturas por 90 min a 37 °C.
       nota: Alternativamente, células e grânulos podem ser ressuspensos em tampão HBS / HSA (BSA) em vez de RPMI livre de vermelho de fenol para a cocultura. Neste caso, a incubação deve ser realizada em uma incubadora não-CO₂, pois esse gás acidificará rapidamente o tampão na ausência de bicarbonato.
   18. Resfrie as coculturas de células BSLB-T incubando primeiro as células em RT por um mínimo de 15 min. Proteja-as da luz.
   19. Centrifugar as células durante 5 minutos a 500 × g e RT; rejeitar o sobrenadante.
   20. Ressuspenda as células em RT 2% BSA-PBS (livre de Ca₂⁺ e Mg₂⁺) para bloqueio. Coloque as células no gelo por 45 min. Proteja da luz.
   21. Durante a incubação das células, prepare a mistura principal de anticorpos usando BSA a 2% filtrada a 0,22 μm gelada em PBS como tampão de coloração, o que fornecerá bloqueio extra.
       nota: Alguns lotes de anticorpos conjugados aos corantes Violeta Brilhante tendem a se ligar aos BSLBs de forma inespecífica. O bloqueio com 5% de BSA-PBS ajuda a reduzir esse ruído. A partir de agora, certifique-se de manter a cadeia de frio intacta.
   22. Centrifugar as coculturas a 500 × g durante 5 min e 4 °C. Antes de descartar os sobrenadantes, certifique-se brevemente de que o pellet esteja presente, inspecionando o fundo da placa de 96 poços usando uma luz de fundo.
   23. Usando uma pipeta multicanal, ressuspenda as células na mistura principal de coloração contendo concentrações otimizadas de anticorpos.
       nota: Use ponteiras de pipeta sem filtro para evitar a geração de bolhas e erros na distribuição dos volumes de coloração.
   24. Inclua células marcadas com isotipo e BSLBs, BSLBs fluorescentes e não fluorescentes e células e BSLBs coradas isoladamente. Respeite o número total de eventos por alvéolo para todos os controles (ou seja, apenas BSLBs contendo 5 × 10⁵ BSLB/poço, e apenas controles de células contendo 5 × 10⁵ células/poço para evitar um aumento relativo de anticorpos por evento corado).
   25. Misture delicadamente pipetando para cima e para baixo metade do volume e incube por 30 min no gelo. Proteja da luz.
   26. Lave as células e BSLBs duas vezes usando BSA-PBS 2% gelado, pH 7,4 e etapas de sedimentação de 500 × g por 5 min a 4 ° C. Ressuspenda as coculturas lavadas em 100 μL de PBS e adquira imediatamente.
   27. Se a fixação for necessária, fixe usando 0,5% p / v de PFA em PBS por 10 min, lave uma vez e mantenha em PBS até a aquisição. Proteja da luz.
   28. Antes da compensação, adquira os padrões MESF, garantindo que as populações mais escuras e mais brilhantes caiam na faixa linear de medição.
   29. Adquira amostras de compensação, calcule a compensação e aplique a matriz de compensação (link) ao experimento.
   30. Adquira e salve um mínimo de 2 × 10⁴ padrões MESF totais para cada um dos canais de quantificação.
   31. Para aquisição usando amostradores de alto rendimento, defina a aquisição do instrumento para o padrão, defina a aquisição da amostra para 80 μL (ou 80% do volume total), taxa de fluxo de amostra entre 2,0 e 3,0 μL/s, volume de mistura de amostra de 50 μL (ou 50% do volume total para evitar a formação de bolhas durante a mistura), mistura de amostra de 150 μL/s, e mistura por poço entre 3 e 5.
   32. Adquira um mínimo de 1 × 10⁴ BSLBs individuais por amostra (consulte os painéis da Figura 3B (i) a (vi) para a estratégia de gating de referência).
   33. Lave o citômetro funcionando por 5 minutos com uma solução de limpeza seguida de 5 minutos de água ultrapura antes de desligar o instrumento. Se estiver usando o HTS, siga as opções na guia HTS e a opção Limpar.
   34. Exporte arquivos FCS.

3. Medindo a transferência sináptica de partículas para BSLBs

1. Abra os arquivos FCS do experimento. Selecione a população de células e BSLBs com base em suas áreas de dispersão de luz lateral e frontal (SSC-A versus FSC-A), conforme mostrado na Figura 3B (i).
2. Selecione os eventos dentro da janela de aquisição contínua (Figura 3B (ii)).
3. Concentre-se nos eventos únicos de ambas as células e BSLB; identifique células únicas primeiro com base em W baixo nas portas sequenciais FSC-W/FSC-H (singlets-1, Figura 3B painel (iii)) e SSC-W/SSC-H (singlets-2; Figura 3B painel (iv)). Defina uma porta singlets-3 adicional selecionando eventos com FSC-A e FSC-H proporcionais (Figura 3B, painel (v)).
4. Extrair o IFM das fracções MESF em branco e 1 a 4 e das células individuais e MESF para cada amostra experimental.
5. Gere valores de IFM corrigidos (cMFI) para as frações 1 a 4 do MESF subtraindo o IFM da população de contas em branco de cada fração.
6. Gerar cMFIs para BSLBs e células individuais (consulte o painel da Figura 3C (i)).
7. Use o sinal de BSLB corado com anticorpos de controle de isotipo para corrigir o MFI de BSLB corado com anticorpos contra os marcadores de células T relevantes. Use o cMFI para calcular a porcentagem de transferência sináptica normalizada (NST%) usando a equação mostrada no painel da Figura 3C (ii).
8. Se estiver interessado nas partículas especificamente transferidas em resposta ao disparo do TCR, subtraia o sinal de BSLBs nulos do MFI de BSLBs agonísticos. Use este cMFI para calcular o NST% orientado por TCR usando a equação mostrada no painel da Figura 3C (ii).
9. Se estiver interessado em determinar o número total de moléculas transferidas como carga de partículas através da interface T cell-BSLB, adquira contas de referência MESF usando as mesmas configurações de instrumento e sessão de aquisição para coculturas T cell-BSLB.
10. Analise as populações de contas MESF e extraia seus cMFIs. Calcule a inclinação da linha de melhor ajuste para a análise de regressão de MESF sobre cMFI.
11. Use a inclinação calculada para extrair o número de MESF depositado em BSLBs. Use cMFIs calculados usando controles de isotipo ou BSLB nulo como brancos para extrair o número de MESF transferidos especificamente para estimular BSLBs.
12. Calcular o número de moléculas de marcadores transferidas para BSLB dividindo os MESF calculados (médios) por BSLB pelo valor F/P do anticorpo de quantificação.

Resultados

Figura 1: Quantificação absoluta de proteínas na superfície de APCs. (A) Exemplo de medições quantitativas de citometria de fluxo de ICAM-1 na superfície das células B tonsilares (Foll. Bc) e células T auxiliares (TFH). (i-vii) Estratégia de bloqueio para analisar CXCR5+ Bc e TFH isolados de amígdalas palatinas humanas. É mostrada a estratégia de gating sequencial pa...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura de células de 96 poços com fundo em U com tampa, tratamento para cultura de tecidos, não pirogênico	Costar®	3799	Para coloração FCM e co-cultura de BSLB e células.
Placa de cultura celular de 96 poços com fundo em V com tampa, tratamento de cultura de tecidos, não pirogênico.	Costar®	3894	Para coloração FCM de células ou grânulos em suspensão.
Alexa Fluor 488 NHS Éster (Éster Succinimidílico)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Éster Alexa Fluor 647 NHS (éster succinimidílico)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 e A20006
Multipoço 6 poço Cultura de tecidos tratada com plasma de gás a vácuo	falcão	353046	Para cultura e expansão de células T CD4+ e CD8+ purificadas.
Caseína de leite bovino, adequada para substrato para proteína quinase (após desfosforilação), pó purificado
Dynabeads Ativador T Humano CD3 / CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12321D	Para a remoção de Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 em volumes inferiores a 2 mL
DynaMag-15™	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12301D	Para a remoção de Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 em volumes inferiores a 15 mL
Soro Fetal Bovino Qualificado, Um Sho	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Necessita de inativação de calor por 30 min a 56 oC
CD154 anti-humano (CD40L), clone 24-31	BioLegend	310815 e 310818	Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647 conjugados, respectivamente
Hamster armênio IgG Alexa Fluor 647 Controle de isotipo, clone HTK888	BioLegend	400902	Rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico)
Configuração do citômetro BD e grânulos de rastreamento	Becton Dickinson & Company (BD)	641319	Acompanhamento de desempenho de instrumentos antes do FCM quantitativo