O método a seguir é adaptado para testar cepas concorrentes com cepas produtoras de inibidores.
NOTA: Este protocolo envolve a geração de aerossóis com culturas bacterianas. Isso só pode ser realizado em um espaço confinado com a implementação de considerações de segurança aprovadas localmente. A pulverização da cultura nas placas de ágar dentro de um gabinete de segurança de nível 2 minimizará a contaminação das placas de ágar e do ambiente circundante. Isso também protegerá o pesquisador da inalação de aerossóis das bactérias pulverizadas, esta é uma grande preocupação se o pesquisador estiver usando organismos de nível 2 de contenção. Equipamento de proteção individual adequado deve ser usado. A área ao redor da placa de Petri é melhor coberta com tecido absorvente descartável. Recomenda-se a descontaminação pós-pulverização usando luz UV.
1. Preparando as placas de ágar
- Prepare o ágar para infusão cérebro-coração (BHI) de acordo com as instruções do fabricante.
- Autoclave o ágar BHI a 121 °C, 15 libras-força por polegada quadrada (psi) por 20 min, ou de acordo com as recomendações do fabricante da autoclave, para esterilizar.
- Despeje alíquotas de 15 ml de ágar BHI esterilizado em placas de Petri estéreis e deixe endurecer.
nota: Certifique-se de que todas as placas de ágar a serem usadas no ensaio sejam originárias do mesmo estoque de ágar e que haja a mesma quantidade de ágar em cada placa. Isso limita a variabilidade nos nutrientes disponíveis e a difusão do inibidor entre as placas, permitindo a comparabilidade.
2. Preparando caldo estéril
- Prepare o caldo BHI de acordo com as instruções do fabricante.
- Adicione alíquotas de 10 ml de BHI a garrafas universais de vidro de 28 ml.
- Autoclave o caldo BHI a 121 °C, 15 psi por 20 min, ou de acordo com as recomendações do fabricante da autoclave, para esterilizar.
nota: Certifique-se de que todo o caldo usado no ensaio seja originário do mesmo lote de caldo autoclavado ao mesmo tempo para limitar a variação de nutrientes que pode causar variação nos resultados.
3. Preparando a(s) garrafa(s) vaporizadora(s) estéril(is)
- Desmonte o frasco do vaporizador.
- Pulverize 5% de agente de limpeza tensoativo através do vaporizador para eliminar contaminantes internos e mergulhe o frasco do vaporizador, a tampa e o vaporizador no agente de limpeza tensoativo a 5% durante a noite.
nota: Luvas e equipamentos de proteção individual apropriados devem ser usados ao manusear agentes de limpeza tensoativos.
- Seque o vaporizador, a tampa e as garrafas sob uma capa de fluxo de ar estéril.
- Encha a garrafa com etanol a 70%, recoloque o vaporizador e borrife um pouco do etanol através do vaporizador.
- Coloque a tampa no vaporizador e guarde o etanol dentro até o uso.
- Imediatamente antes de usar, enxágue assepticamente o frasco com caldo BHI estéril e borrife o caldo através do vaporizador.
nota: Isto evita que o etanol afecte o inóculo adicionado ao frasco no ponto 6.3.
4. Preparando a(s) cultura(s) bacteriana(s) noturna(s)
- Colocar as estirpes concorrentes e inibidoras numa placa de ágar BHI estéril e incubar a 37 °C aeróbica durante aproximadamente 18 horas (durante a noite).
nota: Esta placa produz um estoque de bactérias que podem ser usadas para várias réplicas na mesma semana quando armazenadas a 4 °C.
- Inocular 10 ml de caldo BHI estéril com uma única colónia da estirpe bacteriana concorrente necessária num frasco universal de 28 ml.
- Incubar o frasco universal a 37 °C aeróbica durante a noite, agitando a 250 rpm num agitador orbital.
5. Cultura pontual do isolado produtor de inibidores
- Preparar a(s) cultura(s) noturna(s) conforme descrito na secção 4.
- Certifique-se de que as placas de ágar estejam completamente secas, sem condensação na tampa, antes da inoculação (por exemplo, incubando a placa por 60 minutos a 37 °C); isso evita que o inóculo se espalhe pela placa a partir do local da inoculação.
- Pipetar 25 μl da cultura durante a noite para o centro das placas de ágar. Evite pressionar completamente o êmbolo da pipeta para evitar bolhas de ar que pulverizam a cultura no ágar.
- Deixe a cultura secar em temperatura ambiente para limitar a propagação da cultura. Incubar as placas de ágar a 37 °C aeróbica durante a noite.
6. Preparação do inóculo de pulverização da(s) estirpe(s) concorrente(s) de ensaio
- Prepare a cultura noturna conforme descrito na seção 4. Diluir a cultura durante a noite 10 vezes em caldo BHI para produzir aproximadamente 4 x 106 unidade formadora de colônias (UFC) ml-1 e uma suspensão de OD600 0,3 ±0,05.
nota: Uma diluição de 10 vezes não dará 4 x 106 UFC ml-1 para todas as espécies bacterianas, calcule o fator de diluição necessário espalhando diluições seriais entre 1 x 10-1-1 x 10-6.
- Despeje a cultura diluída em um frasco vaporizador de perfume de plástico estéril.
nota: O volume total deve ser superior ao necessário para o número de placas de ágar a pulverizar. Aproximadamente 250 μl por placa é adequado para uma placa de Petri de 9 cm de diâmetro.
7. Ensaio de inibição de crescimento diferido
- Pulverize a cultura através de cada um dos frascos do vaporizador para garantir que a cultura seja carregada no mecanismo de pulverização antes de pulverizar no ágar.
- A uma distância de aproximadamente 15 cm acima do ágar, pulverizar aproximadamente 250 μl de cultura diluída (3 pulverizações de um vaporizador típico de 50 ml) em toda a superfície do ágar. Incubar as placas de ágar a 37 °C aeróbica durante a noite. Repita para outras placas com o mesmo número de pulverizações.
8. Interpretando os resultados do ensaio de inibição do crescimento diferido
- Meça a zona de inibição do crescimento da cepa concorrente pulverizada (Figura 1A-C, "X" a "X") em milímetros, subtraindo o diâmetro do ponto central do produtor-inibidor (Figura 1A-C, "Y" a "Y").
NOTA: A Figura 1E mostra como esses dados podem ser apresentados
- Registre a pontuação de clareza para zonas de inibição.
nota: Isso indica o grau de inibição observado. Exemplos são mostrados na Figura 1A-D, cepas que podem ser usadas para padronização são sugeridas na seção de resultados representativos. A seguinte escala pode ser usada para pontuação de clareza: uma pontuação de clareza de 0 para descrever uma zona de inibição completa do crescimento da cepa competidora. Uma pontuação de 1 descreve uma zona de inibição quase completa do crescimento, com apenas colônias individuais presentes na zona de clareiramento. Uma pontuação de 2 descreve uma zona visível de crescimento reduzido, o crescimento dentro desta zona é confluente ou quase confluente, mas reduzido em densidade em >50%. Uma pontuação de 3 descreve apenas uma redução mínima do crescimento, o crescimento é confluente e reduzido em menos de 50%, e uma zona ainda é visível e mensurável. Uma pontuação de 4 não descreve nenhuma inibição visível do crescimento. Uma pontuação de 5 descreve que o crescimento da cepa concorrente foi aumentado na proximidade da cepa produtora de inibidor de teste. Veja a Figura 1 para exemplos. Essas pontuações são subjetivas para o experimentador.
