Um ensaio para quantificar salmonela citosólica e vacuolar em macrófagos primários infectados

Resumo

Fonte: Meunier, E., et al. Quantificação de Salmonella Citosólica vs. Vacuolar em Macrófagos Primários por Permeabilização Diferencial. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra um ensaio para quantificar Salmonella typhimurium citosólica e vacuolar dentro de macrófagos derivados da medula óssea usando permeabilização diferencial. Os macrófagos são infectados com uma Salmonella que expressa proteína fluorescente, que é internalizada dentro de uma estrutura vacuolar especializada chamada vacúolo contendo Salmonella ou SCV. Um subconjunto de bactérias escapa do SCV e entra no citosol. A membrana plasmática rica em colesterol dos macrófagos é permeabilizada com digitonina, deixando o VCS intacto. Ao marcar as bactérias citosólicas com um anticorpo marcado com fluorescência, a porcentagem de bactérias vacuolares e citosólicas é quantificada usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).

Protocolo

1. Ensaio de digitonina com Salmonella que expressa mCherry (análise baseada em FACS)

1. Preparação de bactérias
   Nota: Salmonella de tipo selvagem SL1344 (resistente à estreptomicina) expressando mCherry de um plasmídeo (pFPV que codifica mCherry sob o promotor rpsM) é usado neste ensaio. A fagocitose e a proliferação bacteriana não foram alteradas pela expressão constitutiva de mCherry (dados não mostrados).
   1. Inocular a estirpe 1 dia antes da infeção em 3 ml de meio LB suplementado com estreptomicina (90 μg/ml) e ampicilina (100 μg/ml, vetor de expressão mCherry) num shaker a 37 °C O/N.
2. Células de revestimento para infecção.
   1. Semear BMDMs do tipo selvagem em uma placa de 24 poços a uma densidade de 1,25 x 10⁵ células/poço em 1 ml de meio primário de macrófagos (DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS, inativado pelo calor, 56 ° C, 30 min), 1% de ácido 4-(2-hidroxietil) -1-piperazineetanossulfônico (HEPES), 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA), 1% de L-glutamina e 10% de sobrenadante L929 (meio condicionado do fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) produzindo células L929). Os poços de sementes de acordo com a Tabela 1 levam em conta as condições individuais. Adicione lamínulas aos poços usados como controles (Tabela 1).
   2. Incubar as células durante a noite em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂.
3. Preparando a bactéria para infecção.
   1. No dia seguinte, determine a concentração de Salmonella na cultura noturna diluindo a cultura 1:10 em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e medindo o OD₆₀₀ contra um controle somente de PBS. Isso garante que o OD₆₀₀ seja medido na faixa linear do espectrofotômetro.
   2. Calcular a concentração de Salmonella por ml. Um OD₆₀₀ de 1 corresponde a 1 x 10⁹ bactérias.
   3. Dilua as bactérias em um meio de macrófagos para atingir uma concentração de Salmonella de 1,25 x 10⁶ células / ml.
4. Infecção de células com Salmonella.
   1. Remova o meio dos BMDMs. Adicione 1 ml de meio macrófago aos alvéolos de controle não infectados (B1-B3, C1-C3). Adicionar 1 ml de suspensão de Salmonella aos alvéolos A1 - A5 para atingir uma multiplicidade de infeções (m.o.i.) de 10 bactérias por célula.
   2. Centrifugue a placa por 15 min a 300 x g a 37 ° C para sincronizar a infecção. Transferir a placa para uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂.
5. Matando Salmonella extracelular com Gentamicina.
   1. 1 hora após a infecção, remova a placa da incubadora e adicione 0,1 ml de meio macrófago contendo 0,1 mg / ml de gentamicina para matar bactérias extracelulares. Adicione gentamicina a todos os poços, mesmo a controles não infectados, para garantir que todas as células sejam tratadas da mesma maneira. Transferir a placa para uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂.
6. Lavando as células.
   1. Às 2 horas após a infecção, remova a placa da incubadora e lave todos os poços 2x com 1 ml de DMEM simples (pré-aquecido a 37 ° C) e substitua-o por meio de macrófagos (pré-aquecido a 37 ° C) contendo 10 μg / ml de gentamicina para evitar o crescimento de qualquer bactéria extracelular remanescente. Transferir a placa para uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂.
7. Preparação de tampões frescos com detergentes e anticorpos.
   1. Imediatamente antes do ponto de tempo desejado para análise, prepare uma nova solução de estoque de digitonina a 1 mg / ml em tampão KHM (acetato de potássio 110 mM, HEPES 20 mM, MgCl₂ 2, pH 7,3). Filtrar a massa e diluir em tampão KHM até uma concentração de trabalho de 50 μg/ml de digitonina. Além disso, prepare uma solução de saponina a 0,1% em tampão KHM, anticorpo anti-Salmonella acoplado a isotiocianato de fluoresceína (CSA-1-FITC) a 1/500, anti-calnexina a 1/100 ou anti-proteína dissulfeto isomerase (anti-PDI) a 1/100 em tampão KHM suplementado com albumina de soro bovino a 3% (BSA).
8. Permeabilização celular.
   1. Remova a placa da incubadora e lave os poços 3x com 0,5 ml de tampão KHM (pré-aquecido a 37 °C). Remova o tampão KHM e adicione 0,25 ml de tampão KHM simples aos poços A4 e B1 / C1, tampão KHM com digitonina aos poços A1 - A3 e B2 / C2 ou tampão KHM com saponina aos poços A5 e B3 / C3 (conforme Tabela 1). Incubar por exatamente 1 min em RT e lavar imediatamente todos os poços 3x com 0,5 ml de tampão KHM (pré-aquecido a 37 °C).
9. Coloração primária de anticorpos.
   1. Remova o tampão KHM e adicione as soluções de anticorpos primários (cabra anti-Salmonella-FITC, 250 μl / poço, 0,1 μg / ml) aos poços apropriados (Figura 1, Tabela 1). Incubar a placa durante 15 min numa incubadora a 37 °C e 5% de CO₂.
   2. Lave as células 1x com 1 mL de PBS.
10. Células infectadas (poços A1 - A5): análise FACS
    1. Lave as células 3x com PBS e adicione 0,5 mL de PBS gelado contendo 0,1% de Triton. Transfira para um tubo FACS de 5 mL com uma tampa de filtro de célula para quebrar os agregados celulares. Mantenha as amostras no gelo.
    2. Analise as amostras de FACS. Usando os controles totalmente permeabilizados, defina o portão para bactérias totais com base na dispersão direta e lateral (FSC / SSC) primeiro e no sinal mCherry (filtro de 610 nm ± 20 nm).
    3. Em seguida, analise o sinal FITC na população bacteriana total usando os controles totalmente permeabilizados e não permeabilizados para definir as portas para bactérias citosólicas (FITC+, mCherry+) e bactérias vacuolares (FITC-, mCherry+) (Figura 2).
    4. Com as portas definidas, analise as amostras e determine a porcentagem de bactérias citosólicas vs. vacuolares usando o software FlowJo de acordo com o protocolo do fabricante.

Tabela 1: Esquema de plaqueamento para macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) em um formato de 24 poços para infecção subsequente por Salmonella, permeabilização e coloração.

		Permeabilização		Coloração
	Lamínula de vidro	Salmonella	Digitonina	saponina	anti-Salmonella	anti-Calnexina	anti-PDI
A1 (amostra)	-/+*	+	+		+
A2 (amostra)	-/+*	+	+		+
A3 (amostra)	-/+*	+	+		+
A4 (sem controle de permeabilização)	-/+*	+			+
A5 (controle completo de permeabilização)	-/+*	+		+	+
B1 (corado para calexina)	+					+
B2 (corado para calnexina)	+		+			+
B3 (corado para calnexina)	+			+		+
C1 (corado para PDI)	+						+
C2 (corado para PDI)	+		+				+
C3 (corado para PDI)	+			+			+

Resultados

Figura 1. Representação esquemática do protocolo 1. As células infectadas contendo Salmonella mCherry-positiva, seja em vacúolos intactos ou no citosol, são diferencialmente permeabilizadas com digitonina. As Salmonella citosólicas são coradas com anti-Salmonella acoplada ao FITC. As células são lavadas e lisadas com Triton X-100 para análise FACS. As células de controle ne...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Digitonina	sigma	D5628	50ug/mL
PFA	mpbio	219998380
HEPES	Tecnologias da Vida	15630
Acetato de potássio	sigma	791733
MgCl2	sigma	M8266
Bsa	sigma	A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexina	Enzo Ciências da Vida	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Ciências da Vida	SPA-890	1/100
saponina	sigma	Nº 47036
Meio de montagem Vectashield	Laboratórios vetoriais	H-1200
Anticorpo-488 anti-coelho	Sondas Moleculares	A-11070	1/500
gentamicina	Tecnologias da Vida	15710-49	100ug/mL e 10ug/mL
Tritão X-100	Promega	H5141
Pbs	Gibco	20012-019
DMEM	sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
FACS Fortessa	Tecnologias BD		detecção mCherry 610 nm
FACS Fortessa	Tecnologias BD		detecção FITC 530 nm