Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Preparação de tampão para coleta de sangue humano e isolamento de plaquetas lavadas
- Prepare uma solução aquosa de 100 mL de ácido-citrato-dextrose (ACD) dissolvendo 1,4 g de ácido cítrico monohidratado (C6H8O7•H2O, 66,6 mM), 2,5 g de citrato trissódico di-hidratado (Na3C6H5O7•2 H2O, 85 mM) e 2 g de D(+)-glicose anidra. O pH da solução é de cerca de 4,5.
- Prepare soluções de estoque para o tampão de Tyrode da seguinte forma
- Prepare a solução estoque 1 dissolvendo 80 g de cloreto de sódio (NaCl), 2 g de cloreto de potássio (KCl), 10 g de bicarbonato de sódio (NaHCO3) e 0,58 g de di-hidrogenofosfato de sódio monohidratado (NaH2PO4 * H2O) em 500 mL de H2O destilado. As respectivas concentrações finais são 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM e 8,4 mM. Manter a solução a 4 °C.
- Prepare a solução estoque 2 dissolvendo 10,15 g de dicloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2 * 6 H2O) (100 mM) em 500 mL de água destilada (H2O). Manter a solução a 4 °C.
- Preparar a solução-mãe 3 dissolvendo 10,95 g (100 mM) de cloreto de cálcio hexa-hidratado CaCl2*6 H2O em 500 ml de H2O destilado. Manter a solução a 4 °C.
- Prepare o tampão de Tyrode diluindo 2,5 mL de solução estoque 1 em um volume final de 50 mL com H2O destilado. Isso corresponde a concentrações finais de 136,5 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 11,9 mM NaHCO3 e 0,42 mM NaH2PO4*H2O. Ajuste o pH para 7,35 e esterilize filtrando com filtros de 0,22 μm.
- Prepare o tampão albumina 0,35% de Tyrode (tampão TA) diluindo 5 mL de solução estoque 1, 1 mL de solução estoque 2, 2 mL de solução estoque 3, 0,5 mL de HEPES 1M, 1,8 mL de albumina sérica humana 200 g / L e 0,1 g de D(+)-glicose anidra em um volume final de 100 mL de H2O destilado.
- Ajuste o pH para 7,35 com ácido clorídrico 1N (HCl) e ajuste a osmolaridade para 295 mOsm/L adicionando H2O destilado (10% do volume total). As concentrações finais nesta solução são 124 mM NaCl, 2,44 mM KCl, 10,82 mM NaHCO3, 0,38 mM NaH2PO4 * H2O, 0,91 mM MgCl2 * 6 H2O, 1,82 mM CaCl2 * 6 H2O. Mantenha o tampão TA a 37 ° C durante todo o experimento.
2. Coleta de sangue
- Colete 45-50 mL de sangue venoso, da veia antecubital usando uma agulha de 19 G e torniquete baixo ou nenhum, em tubos de 50 mL contendo anticoagulante ACD (1 volume de ACD para 6 volumes de sangue). Descarte os primeiros 1-2 mL de sangue para evitar a presença de trombina e fator tecidual.
- Após a coleta, misture o sangue com o ACD invertendo suavemente o tubo. Incubar a amostra durante 10 min a 37 °C.
3. Preparação de Plaquetas Lavadas Humanas
- Pré-aqueça a centrífuga a 37 °C. Todas as etapas de centrifugação abaixo são realizadas a esta temperatura.
- Despachar o sangue coletado para tubos de 15 mL (5 mL por tubo) e centrifugar a 250 x g por 13 min para obter plasma rico em plaquetas, PRP.
nota: Essa etapa de centrifugação resulta na produção de três camadas na amostra: 1) A camada superior, composta por plasma, plaquetas e uma pequena fração de glóbulos brancos. 2) A camada intermediária, uma porção rica em glóbulos brancos. 3) A camada inferior, que é essencialmente composta de glóbulos vermelhos.
- Colete o PRP pipetando cuidadosamente a camada superior em um novo tubo de 15 mL para evitar ao máximo a contaminação com glóbulos vermelhos e brancos e incube por 10 min a 37 ° C.
- Centrifugue o PRP a 2.200 x g por 12 min (para 5 mL de PRP).
nota: Esta etapa de centrifugação deve ser realizada com freio baixo ou sem freio.
- Remova o sobrenadante (plasma pobre em plaquetas) e ressuspenda cuidadosamente o pellet com 10 mL de tampão TA contendo 2 μL / mL de heparina (5.000 U / mL) e 2,5 μL / mL de prostaciclina 25 μM (PGI2) usando uma pipeta de plástico Pasteur. Incubar durante 10 min a 37 °C.
- Adicione 2,5 μL / mL de prostaciclina-I2 25 μM (PGI2) e centrifugue por 8 min a 1.900 x g (com freio baixo ou sem freio).
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 5 ml de tampão TA contendo 2,5 μL/ml de 25 μM de PGI2 utilizando uma pipeta de plástico de Pasteur. Incubar durante 10 min a 37 °C.
- Durante o período de incubação, pipete 150 μL da suspensão plaquetária em um tubo de 1,5 mL e conte as plaquetas, usando um contador de células automatizado (que detecta o tamanho das células sanguíneas medindo as mudanças na resistência à corrente contínua).
- Após a incubação de 10 minutos, adicione 2,5 μL / mL de 25 μM PGI2 à suspensão plaquetária e centrifugue imediatamente a 1.900 x g por 8 min.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet a uma concentração de 250.000 plaquetas/μL com um volume adequado de tampão TA (ou seja, se a contagem de células for de 500.000 por μL, ressuspenda em 10 mL de tampão TA) contendo 32 μL/mL de apirase a 0,01 U/mL (concentração final 0,32 U/mL).
nota: Uma alta concentração de apirase é usada para evitar a dessensibilização do purinoceptor P2X 1, receptores P2X1 induzida pela secreção espontânea de trifosfato de adenosina (ATP) na ausência de agonistas. Isso é importante porque as respostas induzidas pelo colágeno são induzidas pela rápida ativação parácrina / autócrina de P2X1 pelo ATP liberado das plaquetas ativadas. Se a via de sinalização plaquetária não exigir criticamente a preservação da função P2X1, use apirase 0,02 U/mL. Vários estudos demonstraram que a apirase 0,02 U/mL evita o receptor de adenosina difosfato ADP, o purinoceptor P2Y 1 e a dessensibilização P2Y1 com respostas P2X1 insignificantes.
- Incubar a suspensão celular durante, pelo menos, 30 minutos a 37 °C antes de efectuar as medições agregométricas. A preparação é estável por 5 a 8 horas.
4. Agregometria
- Prepare o fibrinogênio (56 mg / mL) no tampão de Tyrode.
- Pipetar 260 μL de suspensão de plaquetas em cubetas de vidro (Figura 1A; cubeta esquerda) contendo 10 μL de fibrinogênio (56 mg / mL) e uma haste de agitação magnética e, em seguida, incubar a suspensão por 2 a 3 minutos a 37 ° C em poços de incubação presentes no agregômetro (Figura 1B e 1C).
- Pré-incubar com o inibidor de Panx1 Brilliant Blue FCF adicionando 10 μL de uma solução estoque de 2,8 mM ou 28 mM (concentração final de 100 μM e 1 mM, respectivamente) por 7 min a 37 °C.
- Calibre o aggregômetro para um valor de agregação presuntivo de 100% medindo a densidade óptica (DO) de uma cubeta contendo 10 μL de fibrinogênio (56 mg/mL), 10 μL de Bright Blue FCF (2.8 mM ou 28 mM) e tampão TA sem plaquetas.
- Coloque a cubeta em um poço de agregação sob agitação automática e pressione o botão correspondente no teclado do computador conectado ao agregômetro (ou seja, pressione F1 se o poço de agregação 1 for usado).
nota: Este experimento descrito abaixo inclui Brilliant Blue FCF. O composto utilizado para calibração tem de ser ajustado à condição experimental.
- Calibre o agregometer para um valor de agregação presuntivo de 0% utilizando a mesma amostra de plaquetas que será utilizada para a experiência sob agitação automática.
- Coloque a cubeta no poço de agregação e pressione o botão correspondente no teclado do computador vinculado ao agregometro. Aguarde cerca de 20-30 s antes de prosseguir. Esse atraso serve para garantir que nenhuma agregação ocorra antes da adição dos agonistas.
nota: Como qualquer diferença no número de plaquetas pode afetar a DO medida, a etapa de calibração de 0% precisa ser repetida para cada medição individual.
- Adicione 20 μL de agonista desejado, como 15 μg / mL de colágeno (1 μg / mL final) ou 1,125 mM de ácido araquidônico (75 μM final), na cubeta. Inicie imediatamente a gravação sob agitação automática contínua pressionando o botão correspondente no teclado do computador vinculado ao agregometer.
nota: A adição do agonista induz a ativação plaquetária. Os agregados plaquetários podem ser claramente distinguidos na cubeta de vidro no final do experimento (Figura 1A; cubeta direita).
- A gravação pára automaticamente após 6 min. Neste ponto, salve os dados clicando no ícone salvar no computador.
nota: O cálculo da taxa de agregação é realizado pelo computador, que expressa os resultados finais do processo de agregação como uma porcentagem.
