Um ensaio celular para a identificação de agentes que interagem com CXCR4

Resumo

Fonte: Claes, S. et al., Um ensaio de mobilização de Ca²⁺ baseado em fluorescência cinética para identificar agonistas, antagonistas e moduladores alostéricos de receptores acoplados à proteína G.J. Vis. Exp.(2018)

Este vídeo ilustra um ensaio celular envolvendo células de glioblastoma que expressam receptores de quimiocinas CXCR4. O ensaio emprega um corante sensível ao cálcio para medir as mudanças de fluorescência na interação do agente, oferecendo informações sobre a dinâmica da sinalização celular.

Protocolo

NOTA: Todas as etapas descritas nas seções 1 e 2 são realizadas em condições estéreis em um gabinete de fluxo laminar.

1. Manutenção do U87. Células CD4.hCXCR4

1. Cultive as células em frascos de cultura T75 a 37°C e 5% de CO₂ em uma incubadora umidificada.
   nota: A linhagem celular in vitro utilizada neste protocolo é uma linhagem celular de glioblastoma U87 que expressa de forma estável o cluster de diferenciação 4 (CD4) e o receptor de quimiocina CXC humano 4 (CXCR4) e foi descrita anteriormente. A expressão da superfície celular de CD4 e CXCR4 é continuamente monitorada por citometria de fluxo e os níveis de expressão permanecem constantes ao longo do tempo (~ 100% CD4⁺ e ~ 100% CXCR4⁺ células). Uma descrição detalhada da geração da linhagem celular utilizada e do procedimento de citometria de fluxo para investigar os níveis de expressão do receptor não está dentro do escopo deste protocolo.
   1. Células de subcultura em 80-85% de confluência. Permita que todos os reagentes atinjam a temperatura ambiente (RT) antes da cultura celular.
   2. Remova o meio de cultura condicionado das células e lave a monocamada celular uma vez com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   3. Adicione 3 mL de ácido tetracético tripsina-etilenodiamina a 0,25% (tripsina-EDTA) e distribua-o uniformemente sobre a monocamada celular. Em seguida, remova o excesso de tripsina-EDTA e incube até 5 min a 37 °C até que as células comecem a se desprender.
   4. Adicionar 10 ml de meio de crescimento completo fresco (meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) + 10% de soro fetal bovino (FBS) + 0,01 M de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfónico (HEPES) + agentes de seleção adequados). Ressuspenda as células pipetando-as suavemente para cima e para baixo. Transfira a suspensão celular para um tubo estéril de 50 mL.
   5. Conte o número de células viáveis usando um método de escolha. No caso das células de glioblastoma U87, a viabilidade geralmente chega a ~ 100%.
      nota: O número de células pode ser determinado de várias maneiras. Usamos rotineiramente um sistema automatizado de análise celular baseado na coloração com azul de tripano (consulte a Tabela de Materiais) de acordo com seus procedimentos de manuseio padrão, mas outras maneiras devem funcionar igualmente bem.
   6. Adicionar 2 x 10⁶ ou 3 x 10⁶ células (viáveis) a um volume final de 25 mL de meio de crescimento fresco em um frasco de cultura T75 e incubar a 37 °C e 5% de dióxido de carbono (CO₂).
      nota: Se 3 x 10⁶ células forem usadas, as células atingirão 80-90% de confluência após 2 dias. Se forem usadas 2 x 10⁶ células, elas atingirão a mesma confluência após 3 dias. A taxa de crescimento das células deve primeiro ser determinada empiricamente se outras linhagens celulares forem usadas.

2. Semeadura das células para o ensaio de mobilização de Ca²⁺

1. No dia da passagem celular (dia 0), cubra as placas de poliestireno de 96 poços de parede preta com fundo transparente (consulte a Tabela de Materiais) com uma solução de gelatina a 0,1% para facilitar a fixação celular.
   nota: O revestimento das placas de 96 poços com gelatina pode ser omitido se forem usadas placas pré-revestidas, que estão disponíveis comercialmente (consulte a Tabela de Materiais). Recomenda-se avaliar o uso de placas pré-revestidas em vez de revestimento manual para cada linhagem celular sob investigação antes de continuar com o protocolo.
   1. Prepare a solução de gelatina adicionando 1 g de gelatina a 100 mL de PBS para obter uma solução a 1%. Diluir em 10x com PBS antes de continuar a usar. Para melhorar a solubilidade da gelatina, aquecer a solução a 37 °C.
   2. Adicione 100 μL de solução de gelatina a 0,1% por poço da placa de 96 poços usando uma pipeta multicanal. Incubar durante 2 h à RT.
2. Enquanto isso, prepare as células para semeadura na placa revestida de 96 poços.
   1. Separar as células do balão de cultura, ressuspendê-las no meio de crescimento fresco e contá-las utilizando o método de coloração com azul de tripano.
   2. Gire as células em um tubo de 50 mL por 5 min a 400 x g em RT.
   3. Ressuspenda as células em um meio de crescimento fresco (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, sem antibióticos) para obter uma densidade celular de 0,1 x 10⁶ células (viáveis) / mL.
3. Remova a solução de gelatina das placas de paredes pretas com fundo transparente, virando a placa e secando-a em um lenço de papel. Adicione 200 μL / poço PBS para remover o excesso de gelatina e vire a placa novamente.
4. Dispense 200 μL da suspensão celular (correspondente a 0,2 x 10⁵ células) por alvéolo na placa de 96 poços revestida com gelatina (a partir de agora, esta placa será doravante denominada "placa de medição").
5. Incubar a placa durante a noite a 37 °C e 5% de dióxido de carbono (CO₂).

3. Carregamento das células com um corante fluorescente sensível a Ca²⁺

1. No dia 1, realize o ensaio de mobilização real de Ca²⁺, começando com o carregamento das células semeadas com o corante fluorescente de ligação de Ca²⁺ fluo-2 acetoximetil (fluo-2 AM).
   1. Prepare o tampão de ensaio adicionando 40 mL de HEPES (1 M) a 200 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS, 10x, sem vermelho de fenol, sem bicarbonato de sódio). Adicione água ultrapura para obter um volume final de 2 L e adicione 4 g de albumina de soro bovino (BSA). Dissolva o BSA por meio de agitação magnética. Ajustar o pH para 7,4 (com hidróxido de sódio, NaOH) e filtrar a solução.
      nota: Durante todas as etapas a seguir, o mesmo tampão, chamado de "tampão de ensaio", é usado.
   2. Prepare uma solução de estoque (4 mM em dimetilsulfóxido (DMSO)) do corante fluorescente sensível a Ca²⁺ fluo-2 AM. Evite a exposição excessiva à luz. Dissolver 1 mg de fluo-2 AM (peso molecular: 1.061 g/mol) em 235,6 μL de DMSO.
   3. Prepare uma solução de trabalho de fluo-2 AM. Para uma placa de ensaio de 96 poços, misture 12,5 μL de solução estoque de fluo-2 AM (4 mM) e 12,5 μL de solução de poliol surfactante não iônico (por exemplo, plurônico f-127) (20% peso/volume em DMSO, consulte a Tabela de Materiais). Adicione 22 μL desta mistura ao tampão de ensaio de 11 mL em um tubo de 15 mL. A concentração final de fluo-2 AM é de 4 μM.
      nota: O surfactante não iônico é usado como agente de dispersão para melhorar a solubilidade aquosa do fluo-2 AM e, consequentemente, para aumentar a carga celular. Para solubilizar o tensoactivo em DMSO, aquecer a amostra a 37 °C e misturar regularmente para obter uma solução homogénea.
   4. Remova o meio de crescimento das células previamente semeadas na placa de medição de 96 poços, virando a placa e secando-a em uma toalha de papel.
   5. Adicione 100 μL de solução de corante de carregamento por poço usando uma pipeta multicanal e incube por 45 min em RT no escuro.

4. Preparação de placas de polipropileno de 96 poços contendo o ligante de quimiocina CXC ligante de quimiocina 12 (CXCL12) ou os compostos sob investigação

1. Obtenha placas de polipropileno (PP) de 96 poços de fundo redondo (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Deixar que a solução-mãe de CXCL12 (1 mg/ml) e a solução-mãe dos compostos sob investigação se equilibrem à RT.
      nota: A solução estoque de CXCL12 é preparada em água ultrapura suplementada com 0,01% de Tween20 e armazenada a -20 °C como alíquotas de uso único.
   2. Prepare uma solução concentrada de 5x de CXCL12 em tampão de ensaio (250 ng/mL, o que equivale a 31,25 nM) e uma diluição concentrada de 5x de cada composto (em tampão de ensaio).
   3. Dispense as soluções de estoque na placa apropriada de 96 poços de acordo com um layout de placa predefinido. Dispensar 75 μL/poço na placa contendo CXCL12 (a "placa de quimiocina") e dispensar 50 μL/poço na placa contendo os compostos (a "placa composta").
      nota: Ambos os compostos e CXCL12 finalmente se tornarão diluídos 5x após a dispensação na placa de medição. Também é importante incluir alvéolos de controle negativo contendo apenas tampão de ensaio tanto na placa composta quanto na placa de quimiocina. Além disso, poços de controle positivo precisam ser incluídos (ou seja, poços com CXCL12 na placa de quimiocina, mas com tampão de ensaio nos poços correspondentes da placa composta).

5. Configurações de protocolo no leitor de microplacas de fluorescência

NOTA: O leitor de microplacas de fluorescência usado neste protocolo é referido na Tabela de Materiais.

1. Ligue primeiro a unidade de resfriamento do leitor de placa de fluorescência e, em seguida, ligue o próprio leitor de fluorescência. Vamos iniciar por alguns minutos e abrir o software do sistema.
2. Crie o protocolo do ensaio usando o menu de arrastar e soltar que inclui as seguintes etapas:
   1. Na caixa "Configurações", selecione 'Read_Mode' com comprimento de onda de excitação: 470-495 nM; e comprimento de onda de emissão: 515-575 nM.
      nota: Os comprimentos de onda selecionados são apropriados para uso com o corante sensível a Ca²⁺, fluo2.
   2. Inclua a caixa "Misturar com TF" (fluido de transferência) para a mistura automática dos compostos na placa composta, que será colocada na fonte 2 posições do dispositivo (consulte a etapa 6.4). Selecione 15 μL de solução em cada poço para ser aspirado e misturado automaticamente três vezes. Ajuste a altura das pontas da pipeta para 20 μL abaixo da superfície do líquido. Defina a velocidade de aspiração e dispensação em 50 μL/s.
      nota: A altura das ponteiras da pipeta refere-se ao volume que fica embaixo das ponteiras da pipeta. Por exemplo, se os poços de uma placa composta contêm 50 μL, uma altura de 30 μL corresponde a 20 μL abaixo da superfície do líquido. O volume da solução composta levada para misturar, a velocidade de mistura, a posição das pontas da pipeta durante a mistura e o número de ciclos de mistura podem ser ajustados usando o software.
   3. Na caixa "Transferir fluido", defina que 20 μL de cada poço da placa composta serão transferidos para a placa de medição. Posicione as ponteiras da pipeta a 20 μL abaixo da superfície do líquido, ou seja, a uma altura de 30 μL durante a aspiração dos compostos e a uma altura de 60 μL durante a dispensação na placa de medição. Defina a velocidade de aspiração em 50 μL/s e a velocidade de dispensação em 25 μL/s.
      nota: A placa composta contém 50 μL de solução por alvéolo (ver passo 4.1.3), pelo que uma altura de 30 μL corresponde a uma posição 20 μL abaixo da superfície do líquido. A placa de medição conterá 80 μL de tampão de ensaio por poço (consulte a etapa 6.3), portanto, uma altura de 60 μL corresponde a uma posição semelhante das pontas.
   4. Selecione o botão "Ler com TF". Durante o primeiro intervalo, selecione 60 leituras (medições fluorescentes) com um tempo de intervalo de leitura de 1 s. Defina que 10 leituras sejam registradas antes de dispensar os compostos na placa de medição e 50 leituras depois. Defina o segundo intervalo com um tempo de intervalo de leitura de 30 segundos e 18 leituras.
      nota: Durante esta etapa, a fluorescência será medida cineticamente (nos intervalos de tempo definidos) por ~ 10 min no total.
   5. Inclua o botão "Dicas de lavagem" no protocolo três vezes. Em cada etapa de lavagem, selecione o tipo de fluido: fluido A (água ultrapura) ou fluido B (etanol a 70%), o número de ciclos de lavagem (1), a velocidade da bomba (Rápida) e o número de cursos (5) durante cada etapa de lavagem.
      nota: Durante a primeira e a última etapa de lavagem, o fluido A é usado, durante a segunda etapa de lavagem, o fluido B é usado.
   6. Inclua a função "Pause Pipettor". Defina o pipetador para pausar por 300 s.
      nota: Ao incluir esta etapa no protocolo, a cabeça do pipetador, que está integrada no dispositivo leitor de placas de fluorescência, fará uma pausa de 5 minutos antes de continuar o protocolo.
   7. Inclua a caixa "Misturar com TF" para permitir a mistura automática da solução CXCL12 na placa de quimiocina, que será posicionada na posição de fonte 3 do dispositivo (consulte a etapa 6.4). Selecione 15 μL de solução em cada poço para ser aspirado e misturado automaticamente três vezes. Durante a aspiração e mistura, posicione as pontas da pipeta 20 μL abaixo da superfície do líquido. A velocidade de aspiração e dispensação é fixada em 50 μL/s.
      nota: Semelhante à etapa 5.2.2, esses parâmetros podem ser ajustados.
   8. Na caixa subsequente "Fluido de transferência", defina que 25 μL de cada poço da placa de quimiocina serão transferidos para a placa de medição. Posicione as pontas 20 μL abaixo da superfície do líquido, ou seja, a uma altura de 55 μL durante a aspiração da placa de quimiocina que contém 75 μL/poço (consulte a etapa 4.1.3) e a uma altura de 80 μL durante a dispensação na placa de medição. Defina a velocidade de aspiração em 50 μL/s e a velocidade de dispensação em 25 μL/s.
   9. Inclua o botão "Ler com TF". Durante o primeiro intervalo, selecione 145 leituras com um tempo de intervalo de leitura de 1 s. Defina que 5 leituras sejam registradas antes de dispensar CXCL12 na placa de medição e 140 leituras depois. Defina o segundo intervalo com um tempo de intervalo de leitura de 6 s e selecione 20 leituras.
      nota: Em conjunto, ao longo de todo o protocolo, são registadas 243 leituras (medições fluorescentes): 78 no passo 5.2.4 e 165 no passo 5.2.9.
   10. Semelhante ao passo 5.2.5, inclua o botão "Dicas de lavagem" três vezes no protocolo.
       nota: A inclusão desta etapa no final do protocolo permite que as pontas possam ser reutilizadas para realizar outro ensaio sem a necessidade de trocar as pontas.
3. Defina a temperatura do dispositivo em 37 °C clicando no botão "Set stage temperatura" e selecionando 37 °C.

6. Executando o ensaio de fluorescência

1. Depois que a placa de medição tiver sido incubada com tampão de carga por 45 min (consulte a etapa 3.1.5), remova o tampão virando a placa e seque-a em um lenço de papel.
2. Lave as células semeadas adicionando 150 μL / poço de tampão de ensaio e incube por 2 min.
3. Remova o tampão novamente virando a placa. Adicione 80 μL/poço de tampão de ensaio com uma pipeta multicanal.
4. Coloque todas as placas no dispositivo em sua posição apropriada: a placa composta na posição fonte 2, a placa de quimiocina na posição fonte 3 e a placa de medição na posição de leitura. Coloque uma caixa de pontas pretas na posição das pontas da fonte 1. Feche a porta do dispositivo e incube por 5 minutos antes de continuar o protocolo.
5. Selecione o botão "Teste de sinal de protocolo" para determinar as unidades de luz relativa de fundo (RLUs) e a variação de fluorescência sobre a placa. Uma nova janela aparecerá. Selecione "Sinal de teste".
   nota: Durante esta etapa, as RLUs de fundo são determinadas pela câmera do dispositivo de carga acoplada intensificada (ICCD), que é integrada ao compartimento óptico do dispositivo leitor de fluorescência. Essas RLUs resultam da excitação do corante sensível ao Ca²⁺ (fluo-2) por diodos emissores de luz (LEDs) (comprimento de onda de saída do LED 470-495 nm). Valores de 8.000 a 10.000 RLUs são adequados para esta aplicação. As RLUs podem, se necessário, ser adaptadas alterando a intensidade de excitação (Select Exc. Intensity) ou a porta da câmera (Select Gate Open). A variância sobre a placa deve ser idealmente inferior a 7,5%.
6. Selecione "Atualizar" se forem obtidos valores de fundo de 8.000 a 10.000 RLUs. Salve o protocolo principal clicando no botão Salvar.
   nota: Ao fazer isso, as configurações do teste de sinal do protocolo serão transferidas para o protocolo principal.
7. Execute o ensaio pressionando o botão "EXECUTAR".

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fluo-2 AM	Abcam	AB142775	Corante sensível fluorescente Ca2+
F-127 Plurônico	sigma	Pág. 2443-250G	Ácido plurônico
gelatina	sigma	G9391
AMD3100	sigma	A5602-5 mg	Antagonista específico do CXCR4
Maraviroc	gentil presente da AnorMed		Medicamento antirretroviral, antagonista do CCR5
Ligante de quimiocina CXCL12	PeproTech	300-28A
Ligante de quimiocina CCL5	PeproTech	300-06
Soro fetal bovino (FBS)	Gibco (Tecnologias de Vida)	10270-106
Albumina de soro bovino (BSA)	sigma	A1933-25G
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco (Tecnologias de Vida)	Nº 41965-039
HBSS (10 x), cálcio, magnésio, sem vermelho de fenol	Gibco (Tecnologias de Vida)	14065-049
HEPES (1 M)	Gibco (Tecnologias de Vida)	Rolamento 15630-056
Tripsina-EDTA (0,25 %), vermelho de fenol	Gibco (Tecnologias de Vida)	Rolamento 25200-056
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)	Gibco (Tecnologias de Vida)	14190-094
Tubos Falcon, 50 mL	Greiner Bio-One	227 261
Balão de cultura de tecidos (T75)	Corning	353024
Placa preta, 96 poços, fundo transparente, com tampa	Costar/Fisher Científico	10530753	Placa de ensaio (96 poços), para semeadura de células
Placas de polipropileno (PP)	Thermo Scientific (VWR)	Rolamento 732-2661	Placas utilizadas para preparar as placas compostas e placas de quimiocinas, fundo redondo
Sistema de triagem celular de alto rendimento FLIPR Tetra	Dispositivos Moleculares		Leitor de placas fluorescentes com cabeça pipetadora integrada e câmera ICCD
Módulo LED FLIPR Tetra 470 - 495 nm	Dispositivos Moleculares	Telefone: 0200-6128	Diodos emissores de luz para excitação do corante fluorescente sensível ao Ca2+
Filtro de emissão FLIPR Tetra 515 - 575 nm	Dispositivos Moleculares	Telefone: 0200-6203	Filtro de emissão compatível com o corante fluorescente
Cabeça FLIPR Tetra 96	Dispositivos Moleculares	0310-4536	Cabeça pipetadora de 96 poços, integrada ao leitor de placas fluorescentes
Tela Funciona	Dispositivos Moleculares		Pacote de software usado para análise e visualização de dados no FLIPR Tetra
VI-CÉLULA	Beckman Coulter		Analisador de viabilidade celular
Microplacas de Poliestireno Preto de Fundo Plano Claro Corning CellBIND 96 Well, com Tampa, Estéril	Corning	3340	Placas de ensaio pré-revestidas de 96 poços que podem representar uma alternativa para o revestimento manual da placa de ensaio.