1. Colheita de células e medição da atividade da α-galactosidase A ou da α-glicosidase ácida
- Colheita de células
- No dia da colheita, retirar as células da incubadora e aspirar o meio. Lave cuidadosamente as células 2 vezes com PBS com Ca2+ e Mg2+.
NOTA: Esta etapa é crítica porque DGJ e DNJ são inibidores potentes da α-galactosidase e da α-glicosidase, respectivamente, e qualquer sobra invalidaria o teste.
- Adicione 200 μL de água deionizada diretamente sobre as células. Enxágue as células da placa e transfira-as para um tubo de reação de 1,5 mL.
2. Homogeneização por congelamento e descongelamento
- Coloque as amostras em um rack de espuma apropriado e vórtice por 5 s para tornar a lise mais eficiente. Colocar as amostras alternadamente em nitrogênio líquido por 10 s e em banho-maria em temperatura ambiente até que o descongelamento esteja completo (5 min).
- Repita este procedimento 5 vezes e, em seguida, gire as amostras por 5 min a 10.000 x g. Retenha o sobrenadante e pipete em um novo tubo de reação.
3. Determinação da concentração de proteínas usando ensaio de ácido bicinchonínico (BCA)
- Preparar um novo tubo para cada amostra contendo 40 μl de H2O desionizado e adicionar 10 μl da amostra. Misturar a solução por vórtice brevemente e transferir 10 μL para uma cavidade de uma placa de 96 poços (cada amostra em triplicata). Diluir uma solução-mãe de albumina de soro bovino (BSA) a 2 mg/ml em H2O desionizado do seguinte modo, para obter uma curva-padrão: 50 μL H2O/50 μL BSA; 60 μL H2O/40 μL BSA; 70 μL H2O/30 μL BSA; 80 μL H2O/20 μL BSA; 90 μL H2O/10 μL BSA; 100 μL H2O.
- Iniciar a reação adicionando 200 μL de reagente BCA (reagente A e reagente B misturados na proporção de 50:1) e incubar por 1 h no escuro a 37 °C sob leve agitação em um agitador orbital (300 rpm). Medir a absorvância a 560 nm num leitor de placas.
nota: As amostras normalmente contêm entre 1 e 1,5 μg de proteína por μL.
4. Medição da atividade enzimática com substratos artificiais de 4-metilumbeliferilo (4-MUG)
- Diluir a quantidade calculada de cada amostra e pipetar em tubos de reação frescos de 1,5 mL para obter 0,05 (para α-galactosidase A) ou 0,5 (para α-glicosidase ácida) μg de proteína / μL soluções. Vortex as amostras por 5 s novamente e pipetar 10 μL desta diluição em uma placa de 96 poços (cada amostra em duplicata).
- Inicie a reação adicionando 20 μL da respectiva solução de substrato:
Para α-galactosidase A: 2 mM 4-metilumbelliferil-α-D-galactopiranosídeo (4-MU-gal) em tampão citrato de fosfato 0,06 M, pH 4,7.
Para α-glicosidase ácida: 2 mM de 4-metilumbeliferil α-D-glicopiranosídeo (4-MU-glu) em acetato de sódio 0,025 M, pH 4,0.
- Incubar as reacções enzimáticas durante 1 h na obscuridade a 37 °C sob ligeira agitação num agitador orbital (300 rpm). Termine a reação com a adição de 200 μL de tampão glicina-NaOH ajustado a 1,0 M, pH 10,5.
- Prepare uma curva padrão de 4-metilumbeliferona (4-MU) a partir de um estoque de 0,01 mg / mL da seguinte forma:
100 μL H2O/ não 4-MU; 80 μL H2O/ 20 μL 4-MU; 60 μL H2O/ 40 μL 4-MU; 40 μL H2O/ 60 μL 4-MU; 20 μL H2O/ 80 μL 4-MU; sem H2O/ 100 μL 4-MU, pipetar 10 μL de cada diluição na placa de 96 poços (em duplicado) e adicionar 200 μL do tampão glicina-NaOH 1,0 M a cada poço para ajustar o volume e o pH.
- Meça a atividade enzimática em um leitor de fluorescência equipado com o conjunto de filtros apropriado e analise os dados usando o software apropriado para o dispositivo leitor de fluorescência.
nota: Ambos os substratos 4-MUG são reduzidos para 4-MU durante a exposição à α-galactosidase A ou à α-glicosidase ácida. O 4-MU liberado é um fluorocromo, que pode ser medido em 360 e 465 nm como comprimentos de onda de excitação e emissão, respectivamente, usando um leitor de fluorescência de microplacas.
