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1. Ensaio de Inativação Viral
Nota: Exemplos de período de incubação e dose viral para vários vírus estão listados na Figura 1A. Concentrações mais altas do vírus também podem ser testadas aumentando o MOI / PFU.
- Semeie células Huh-7,5 em uma placa de 96 poços (1 × 104 células por poço) e incube a 37 ° C em uma incubadora de CO5% 2 O / N para obter uma monocamada.
- Incubar os compostos de ensaio ou os controlos (as concentrações finais são: CHLA = 50 μM; PUG = 50 μM; heparina = 1.000 μg/ml; DMSO = 1%) com as partículas de HCV a 37 ° C (Figura 1A, 'Longo prazo') na proporção de 1:1. Por exemplo, a um inóculo de vírus de 100 μl contendo 1 x 104 FFU, adicione 100 μl de uma diluição de trabalho de CHLA de 100 μM; isso produz o tratamento com CHLA em uma concentração final de 50 μM.
- Diluir a mistura vírus-droga até obter uma concentração "subterapêutica" (ineficaz) dos compostos de ensaio. Por exemplo, a concentração ineficaz de CHLA e PUG contra o HCV é de 1 μM31; portanto, isso requer uma diluição de 50 vezes da mistura vírus-medicamento, que pode ser realizada com 9,8 ml de meio basal (meio de cultura celular com 2% de FBS).
Nota: A diluição para a concentração subterapêutica evita uma interacção significativa entre os compostos de ensaio e a superfície da célula hospedeira e permite examinar o efeito do tratamento nos vírions livres de células. Observe que essa diluição depende da resposta à dose antiviral dos compostos de teste contra a infecção viral específica e é determinada antes da realização deste ensaio específico.
- Para comparação, misture o vírus com os compostos de teste e dilua imediatamente (sem período de incubação) até a concentração subterapêutica antes da infecção (Figura 1A, 'Curto prazo').
- Adicione 100 μl da mistura diluída de HCV-droga na monocamada de células Huh-7.5 (a quantidade de vírus está agora em 1 x 102 FFU; MOI final = 0.01) e incube por 3 horas a 37 ° C para permitir a adsorção viral.
- Após a infecção, remova o inóculo diluído e lave suavemente os poços com 200 μl de PBS duas vezes.
nota: Faça as lavagens suavemente para evitar levantar as células.
- Aplicar 100 μl de meio basal em cada alvéolo e incubar a 37 °C durante 72 horas.
- Analise a infecção resultante testando o sobrenadante para atividade de luciferase.
