Um ensaio de fixação viral para triagem de compostos antivirais

Resumo

Fonte: Tai, C. et al., Ensaios de entrada viral precoce para a identificação e avaliação de compostos antivirais. J. Vis. Exp.(2015)

Este vídeo demonstra um ensaio de fixação viral para triagem de compostos antivirais. Usando o vírus da hepatite C geneticamente modificado e a luciferase, ele avalia os efeitos inibitórios na fixação viral, conforme indicado pela menor intensidade de luz em poços co-tratados em comparação com poços tratados apenas com o vírus.

Protocolo

NOTA: Certifique-se de que todos os procedimentos envolvendo cultura de células e infecção por vírus sejam realizados em capuzes de biossegurança certificados que sejam apropriados para o nível de biossegurança das amostras que estão sendo manuseadas. Para fins de descrição dos protocolos, o vírus da hepatite C (HCV) marcado com repórter Gaussia luciferase é usado como um vírus modelo. No contexto dos resultados representativos, os compostos ácido chebulágico (CHLA) e punicalagina (PUG) são usados como antivirais candidatos que visam as interações da glicoproteína viral com glicosaminoglicanos da superfície celular durante as etapas iniciais de entrada viral. A heparina, que é conhecida por interferir na entrada de muitos vírus, é usada como tratamento de controle positivo em tal contexto. Para obter informações básicas sobre técnicas de virologia, propagação de vírus, determinação do título do vírus e expressão da dose infecciosa em unidades formadoras de placa (PFU), unidades formadoras de foco (FFU) ou multiplicidade de infecção (MOI), o leitor é encaminhado para referência. Para exemplos anteriores e condições otimizadas usadas para vírus mostrados nos resultados representativos, o leitor é encaminhado para referências, bem como detalhes listados na Tabela 1, Figura 1A.

1. Cultura de Células, Preparação de Compostos e Citotoxicidade de Compostos

1. Cultive a respectiva linhagem celular para o sistema de infecção pelo vírus a ser analisado (Tabela 1). Para o HCV, cultive as células Huh-7.5 no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 200 U / ml de penicilina G, 200 μg / ml de estreptomicina e 0.5 μg / ml de anfotericina B.
2. Preparar os compostos de ensaio e os controlos utilizando os respectivos solventes: por exemplo, dissolver CHLA e PUG em dimetilsulfóxido (DMSO); preparar a heparina em água estéril bidestilada Para todas as diluições subsequentes, use meios de cultura.
   NOTA: A concentração final de DMSO nos tratamentos com compostos de ensaio é inferior a 1% nos ensaios; O DMSO a 1% é incluído como tratamento de controle negativo nos ensaios para comparação.
3. Determinar a citotoxicidade dos compostos de ensaio (por exemplo, CHLA e PUG) nas células para a infecção viral utilizando reagentes de determinação da viabilidade celular, tais como XTT (hidróxido de 2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-5-fenilamino)-carbonil]-2H-tetrazólio):
   1. Para o HCV, semeie células Huh-7,5 em uma placa de 96 poços (1 × 10⁴ células por poço) e incube a 37 ° C em uma incubadora de 5% de CO₂ O / N para obter uma monocamada.
   2. Aplique controle DMSO (1%) ou concentrações crescentes dos compostos de teste CHLA e PUG (ex. 0, 10, 50, 100 e 500 μM) aos poços de cultura em triplicata.
   3. Incubar a 37 °C durante 72 horas, depois rejeitar o meio na placa e lavar as células com 200 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes.
   4. Adicione 100 μl de solução de ensaio do kit de ensaio toxicológico in vitro baseado em XTT a cada poço e incube as placas a 37 °C por mais 3 horas para permitir a produção de formazano XTT.
   5. Determinar a absorvância com um leitor de microplacas a um comprimento de onda de ensaio de 492 nm e a um comprimento de onda de referência de 690 nm.
   6. Calcular a percentagem de células sobreviventes utilizando a seguinte fórmula: viabilidade celular (%) = At / As × 100%, em que «At» e «As» referem-se à absorvância dos compostos de ensaio e aos tratamentos de controlo de solventes (ex. 1% DMSO), respetivamente. Determine a concentração de 50% de citotoxicidade celular (CC₅₀) dos compostos de teste a partir de um software analítico como o GraphPad Prism de acordo com o protocolo do fabricante.

2. Leitura da infecção viral

NOTA: A leitura da infecção viral depende do sistema de vírus usado e pode envolver métodos como ensaios de placa ou medição de sinais de repórter de vírus marcados por repórter. O método para detectar a infecção repórter-HCV com base na atividade repórter da luciferase é descrito abaixo.

1. Colete os sobrenadantes dos poços infectados e clareie a 17.000 x g em uma microcentrífuga por 5 min a 4 ° C.
2. Misture 20 μl de sobrenadante de teste a 50 μl de substrato de luciferase do kit de ensaio de luciferase Gaussia e meça diretamente com um luminômetro de acordo com as instruções do fabricante.
3. Expresse a infectividade do HCV como log₁₀ das unidades de luz relativa (RLU) para determinar a inibição viral (%) e calcule a concentração efetiva de 50% (EC₅₀) dos compostos de teste contra a infecção pelo HCV usando algoritmos do software GraphPad Prism de acordo com o protocolo do fabricante.

3. Ensaio de Fixação Viral

NOTA: Exemplos de período de incubação e dose viral para vários vírus estão listados na Figura 1A, 'Anexo'. Concentrações mais altas do vírus também podem ser testadas aumentando o MOI / PFU.

1. Semeie células Huh-7,5 em uma placa de 96 poços (1 × 10⁴ células por poço) e incube a 37 ° C em uma incubadora de CO_{5% 2} O / N para obter uma monocamada.
2. Pré-arrefecer as monocamadas de células em placas a 4 °C durante 1 hora.
3. Co-trate as células com inóculo do HCV (MOI = 0,01) e teste compostos ou controles (as concentrações finais são: CHLA = 50 μM; PUG = 50 μM; heparina = 1.000 μg/ml; DMSO = 1%) a 4 °C por 3 horas. Por exemplo, a um inóculo viral de 90 μl contendo 1 x 10² FFU, adicionar 10 μl de uma diluição de trabalho CHLA de 500 μM; isso resulta em tratamento com CHLA em uma concentração final de 50 μM e uma infecção por HCV em MOI = 0,01 na monocamada celular.
   NOTA: É importante realizar o experimento a 4 °C, pois permite a ligação do vírus, mas impede a entrada que ocorre com mais eficiência a 37 °C. Execute a adição de vírus e compostos de teste no gelo e a subsequente incubação em um refrigerador a 4 °C para garantir que a temperatura seja mantida a 4 °C.
4. Remova o sobrenadante e lave suavemente a monocamada de células com 200 μl de PBS gelado duas vezes.
   NOTA: Realize as lavagens suavemente para evitar levantar as células.
5. Aplicar 100 μl de meio basal em cada alvéolo e incubar a 37 °C durante 72 horas.
6. Analise a infecção resultante testando o sobrenadante para atividade de luciferase, conforme descrito em '2. Leitura da infecção viral'.

Tabela 1: Tipo de célula hospedeira para infecção viral.O tipo de célula usado para cada sistema de infecção viral descrito nos resultados representativos é indicado. Detalhes adicionais sobre as células podem ser encontrados na referência.

vírus	Tipo de célula
HCMV	Hel
AVC	Huh-7.5
DENV-2	Vero
Mv	CHO-SLAM
Vrs	HEp-2

Resultados

Figura 1. Avaliação das atividades antivirais dos compostos de teste CHLA e PUG contra a ligação e entrada/fusão do vírus.(A) O procedimento experimental, a concentração do vírus (PFU/poço ou MOI) e o tempo de adição e tratamento com os compostos de teste (i, ii, iii) são apresentados para cada vírus nos esquemas e nas tabelas associadas. Na análise de ligação de vírus (barras cinza claro), monocamad...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	GIBCO	11995-040
FBS	GIBCO	Rolamento 26140-079
Penicilina-estreptomicina	GIBCO	15070-063
Anfotericina B	GIBCO	15290-018
Dmso	sigma	D5879
Kit de ensaio toxicológico in vitro, baseado em XTT	sigma	TOX2
PBS pH 7,4	GIBCO	10010023
Leitor de microplacas	Instrumento Bio-Tek, Inc.	ELx800
Microcentrífuga	Thermo Científico	75002420
Kit de ensaio de luciferase BioLux Gaussia	Biolabs da Nova Inglaterra	E3300L
Luminómetro	Promega	GloMax-20/20