Observação: Certifique-se de que todos os procedimentos que envolvem cultura de células e infecção por vírus sejam realizados em capelas de biossegurança certificadas que sejam apropriadas para o nível de biossegurança das amostras que estão sendo manuseadas. Para fins de descrição dos protocolos, o HCV marcado com repórter Gaussia luciferase é usado como um vírus modelo. No contexto dos resultados representativos, os compostos ácido chebulágico (CHLA) e punicalagina (PUG) são usados como antivirais candidatos que visam as interações da glicoproteína viral com glicosaminoglicanos da superfície celular durante as etapas iniciais de entrada viral. A heparina, que é conhecida por interferir na entrada de muitos vírus, é usada como tratamento de controle positivo em tal contexto.
1. Cultura de Células, Preparação de Compostos e Citotoxicidade de Compostos
- Cultive a respectiva linhagem celular para o sistema de infecção pelo vírus a ser analisado (Tabela 1). Para o HCV, cultive as células Huh-7.5 no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 200 U / ml de penicilina G, 200 μg / ml de estreptomicina e 0.5 μg / ml de anfotericina B.
- Preparar os compostos de ensaio e os controlos utilizando os respectivos solventes: por exemplo, dissolver CHLA e PUG em dimetilsulfóxido (DMSO); preparar a heparina em água estéril bidestilada Para todas as diluições subsequentes, use meios de cultura.
Nota: A concentração final de DMSO nos tratamentos com compostos de ensaio é inferior a 1% nos ensaios; O DMSO a 1% é incluído como tratamento de controle negativo nos ensaios para comparação.
- Determinar a citotoxicidade dos compostos de ensaio (por exemplo, CHLA e PUG) nas células para a infecção viral utilizando reagentes de determinação da viabilidade celular, tais como XTT (hidróxido de 2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-5-fenilamino)-carbonil]-2H-tetrazólio):
- Para o HCV, semeie células Huh-7,5 em uma placa de 96 poços (1 × 104 células por poço) e incube a 37 ° C em uma incubadora de 5% de CO2 O / N para obter uma monocamada.
- Aplique controle DMSO (1%) ou concentrações crescentes dos compostos de teste CHLA e PUG (ex. 0, 10, 50, 100 e 500 μM) aos poços de cultura em triplicata.
- Incubar a 37 °C durante 72 horas, depois rejeitar o meio na placa e lavar as células com 200 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes.
- Adicione 100 μl de solução de ensaio do kit de ensaio toxicológico in vitro baseado em XTT a cada poço e incube as placas a 37 °C por mais 3 horas para permitir a produção de formazano XTT.
- Determinar a absorvância com um leitor de microplacas a um comprimento de onda de ensaio de 492 nm e a um comprimento de onda de referência de 690 nm.
- Calcular a percentagem de células sobreviventes utilizando a seguinte fórmula: viabilidade celular (%) = At / As × 100%, em que «At» e «As» referem-se à absorvância dos compostos de ensaio e aos tratamentos de controlo de solventes (ex. 1% DMSO), respetivamente. Determine a concentração de 50% de citotoxicidade celular (CC50) dos compostos de teste a partir de um software analítico como o GraphPad Prism de acordo com o protocolo do fabricante.
2. Leitura da infecção viral
Nota: A leitura da infecção viral depende do sistema de vírus usado e pode envolver métodos como ensaios de placa ou medição de sinais de repórter de vírus marcados por repórter. O método para detectar a infecção repórter-HCV com base na atividade repórter da luciferase é descrito abaixo.
- Colete os sobrenadantes dos poços infectados e clareie a 17.000 x g em uma microcentrífuga por 5 min a 4 ° C.
- Misture 20 μl de sobrenadante de teste a 50 μl de substrato de luciferase do kit de ensaio de luciferase Gaussia e meça diretamente com um luminômetro de acordo com as instruções do fabricante.
- Expresse a infectividade do HCV como log10 das unidades de luz relativa (RLU) para determinar a inibição viral (%) e calcule a concentração efetiva de 50% (EC50) dos compostos de teste contra a infecção pelo HCV usando algoritmos do software GraphPad Prism de acordo com o protocolo do fabricante.
3. Ensaio de entrada/fusão viral
Nota: Exemplos de períodos de incubação e doses virais para vários vírus estão listados na Figura 1A 'Entrada/Fusão'. Concentrações mais altas do vírus também podem ser testadas aumentando o MOI / PFU.
- Semeie células de Huh-7,5 em uma placa de 96 poços (1 × 104 células por poço) e incube a 37 ° C em uma incubadora de CO5% 2 O / N para obter uma monocamada.
- Pré-arrefecer as monocamadas de células em placas a 4 °C durante 1 hora.
- Infecte as células com HCV (multiplicidade de infecção, MOI = 0,01) a 4 ° C por 3 horas. Por exemplo, use um inóculo de vírus de 100 μl contendo 1 x 102 unidades formadoras de foco (FFU).
nota: Efectuar a adição do inóculo viral no gelo e a subsequente incubação num frigorífico a 4 °C para manter a temperatura a 4 °C, o que permite a ligação viral, mas não a entrada.
- Remova o sobrenadante e lave suavemente as monocamadas celulares com 200 μl de PBS gelado duas vezes.
nota: Faça as lavagens suavemente para evitar levantar as células.
- Tratar os alvéolos com os compostos de ensaio ou controlos (as concentrações finais são: CHLA = 50 μM; PUG = 50 μM; heparina = 1.000 μg/ml; DMSO = 1%) e incubar a 37 °C por 3 horas. Por exemplo, adicione 10 μl de uma diluição de trabalho CHLA de 500 μM a 90 μl de meio, misture e trate os poços; isso produz tratamento com CHLA em uma concentração final de 50 μM.
nota: A mudança de 4 °C para 37 °C agora facilita o evento de entrada/fusão viral e, portanto, permite a avaliação do efeito dos compostos de teste nesta etapa específica.
- Aspire o sobrenadante contendo o medicamento e remova os vírus extracelulares não internalizados lavando com 200 μl de tampão citrato (50 mM de citrato de sódio, 4 mM de cloreto de potássio, pH 3,0) ou PBS. Aplicar 100 μl do meio basal antes de incubar a 37 °C durante 72 horas.
- Analise a infecção resultante testando o sobrenadante para atividade de luciferase, conforme descrito em '2. Leitura da infecção viral'.
