Detecção colorimétrica de um biomarcador bacteriano usando um teste decisivo modificado

Resumo

Fonte: Tram, K., et al. Detecção colorimétrica de bactérias usando o teste decisivo. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra um método colorimétrico de detecção de E. coli, envolvendo um biomarcador de E. coli ativando um DNAzyme, levando à clivagem da ligação de RNA e ao desprendimento de um conjugado DNAzyme-urease. Um ensaio colorimétrico subsequente detecta o biomarcador E. coli por meio de alterações de pH induzidas por amônia.

Protocolo

1. Preparando células de E. coli para teste

1. Para uma suspensão celular desejada, transfira 1 ml de caldo cultivado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Centrifugue as células a 6.000 x g durante 10 min a 4 °C. Retire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento da célula.
3. Adicione 10 μl de tampão de reação ao pellet celular e ressuspenda as células. Sonicar a suspensão celular durante 5 min. Transfira a suspensão celular para uma caixa de gelo por 5 min.
4. Sonicar a suspensão celular por mais 5 min.
5. Centrifugar a suspensão celular a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C. Utilizar o sobrenadante para o ensaio (10 μl).

2. Teste decisivo

1. Em um tubo de microfúgio de 1,5 ml, pré-lave o tubo adicionando e vórtice 100 μl de tampão de reação (RB) no tubo de microfífugo e descartando o tampão.
2. Transfira 15 μl de EC1 montado para o tubo de microcentrífuga lavado.
3. Lave as contas magnéticas colocando o tubo de microcentrífuga em um rack magnético. Remova o sobrenadante por pipetagem. Remova o tubo de microcentrífuga do rack, adicione 100 μl de RB e ressuspenda cuidadosamente as esferas magnéticas.
4. Lave o MB mais duas vezes repetindo a etapa 2.3.
5. Volte a colocar o tubo de microcentrífugas na cremalheira magnética, retire o sobrenadante e adicione a amostra de 10 μl de E. coli preparada no passo 1.3.
6. Misture a amostra e os grânulos magnéticos com cuidado, batendo suavemente no tubo de microcentrífuga.
7. Incubar a reação à temperatura ambiente durante 1 hora.
8. À reação, adicione 90 μl de ddH₂O e coloque o tubo de microcentrífuga em um rack magnético.
9. Após aproximadamente 3 minutos de separação magnética, transferir cuidadosamente 85 μl do sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Retire o sobrenadante lentamente para evitar a coleta de contas magnéticas.
10. Ao tubo de microcentrífuga acima, adicione 15 μl de vermelho de fenol a 0,04% e 100 μl de solução de substrato.
11. Tire uma fotografia em intervalos de tempo específicos para registrar a mudança de cor.
    nota: A mudança no pH também pode ser monitorada usando um medidor de pH com um microeletrodo. O pH inicial deve ser de aproximadamente 5,2-5,5 (a solução é amarela). Caso contrário, a solução pode ser ajustada pela adição de tampão acetato 1 mM pH 5,0).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	VWR AMRESCO	105
Pellets de hidróxido de sódio (NaOH)	BIO BASIC CANADÁ INC	SB6789
Tris-base	VWR AMRESCO	497
ureia	VWR AMRESCO	M123
Xilenecyanol FF	SIGMA-ALDRICH	X-4126
0,04% de fenol vermelho	SIGMA-ALDRICH	Pág. 3532
10x tampão de reação de polinucleotídeo quinase T4	Lucigen	30061-1
E. coli K12 (MG1655)	ATCC	ATCC700926
Conta magnética (BioMag)	Laboratórios Bangs Inc
Rack de Separação Magnética	BioLabs da Nova Inglaterra	S1506S
Tubos de microcentrífugas	Sarstedt	72,69
Incubadora para cultura celular	Eppendorf Scientific	M13520000
Limpador ultrassônico Branson	Branson	N/A