Um ensaio repórter de luciferase para estudar a regulação da tradução em células infectadas por poxvírus

Resumo

Fonte: Dhungel, P., et al. Ensaio repórter de luciferase baseado em RNA transcrito in vitro para estudar a regulação da tradução em células infectadas por poxvírus. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra um ensaio para estudar a regulação da tradução em células infectadas por poxvírus. Células não infectadas e infectadas por vírus foram co-transfectadas com mRNAs que codificam para luciferase de vaga-lume (Fluc) e luciferase de Renilla (Rluc), com o mRNA de Fluc contendo uma sequência líder de 5 'Poly (A). Ao adicionar substratos bioluminescentes em células lisadas, medir o sinal de ambas as luciferases para identificar a vantagem translacional do mRNA Fluc em células infectadas por vírus, conferida pela sequência líder.

Protocolo

1. Transfectar mRNA para células

1. Semeie as células HeLa em uma placa de 24 poços (para ser aprox. ~ 80-90% confluente no dia seguinte) e incube durante a noite em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO₂.
2. Infecte células HeLa com o vírus vaccinia (VACV) em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5 ou mantenha células HeLa não infectadas para comparação.
   nota: MOI é o número de partículas virais infecciosas por célula.
3. MOI de X = {[(Número de células * X) / Título de vírus] * 1000} μl de vírus por meio de 1 mL.
4. Após h pós-infecção desejada (hpi) (neste experimento a 10-12 hpi), transfecte o mRNA (500 ng de mRNA total por poço de placas de 24 poços) usando um reagente de transfecção lipídica catiônica, conforme mostrado na Figura 1C.
   1. Para um poço de uma placa de 24 poços, misture 480 ng de mRNA de luciferase de vaga-lume (12A-Fluc) e 20 ng de mRNA de luciferase de Renilla (Kozak-Rluc) em um tubo de microcentrífuga. Em outro tubo de microcentrífuga, adicione 1,1 μL de reagente de transfecção lipídica catiônica.
   2. Adicione 55 μL de meio sérico reduzido em ambos os tubos. Misture e incube em temperatura ambiente por 5 min.
   3. Após 5 min de incubação, adicione 55 μL de reagente de transfecção lipídica catiônica contendo meio sérico reduzido em tubo contendo mRNA de mRNA.
   4. Misture delicadamente, mas bem, e incube em temperatura ambiente por 15 min.
   5. Durante a incubação, remova o meio de cultura de células e adicione 400 μL de meio de soro reduzido por alvéolo de placas de 24 poços.
   6. Após a incubação, adicione 100 μL da mistura gota a gota e uniformemente a um poço de placas de 24 poços.

2. Meça as atividades da luciferase

1. Cinco horas após a co-transfecção de mRNA de 12A-Fluc e Kozak-Rluc, meça a atividade da luciferase usando um sistema de ensaio de luciferase capaz de realizar dois ensaios repórter (por exemplo, kit de ensaio Dual-Luciferase Reporter).
2. Remova o meio sérico reduzido e lise as células adicionando 150 μL de tampão de lise 1x, um componente do kit de ensaio de luciferase.
3. Após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, colete o lisado descartando as células e transfira-as para um tubo de microcentrífuga.
4. Centrifugue o lisado a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C para granular os detritos das células.
5. Adicione 30 μL de sobrenadante em uma placa de ensaio branca de 96 poços de paredes opacas com fundo sólido.
6. Meça a luminescência dupla usando o kit de ensaio de luciferase e um luminômetro leitor de placas multimodo.
7. Realize a medição usando a função cinética (por poço) usando as configurações descritas na Tabela 1.
   nota: A leitura também pode ser feita usando um luminômetro manual. Adicione um volume igual de lisado e substrato para Fluc em uma cubeta. Aguarde 2 s e meça por 10 s usando um luminômetro. Após a medição Fluc, retire rapidamente a cubeta do luminômetro e adicione um volume igual do substrato para Rluc manualmente. Novamente, aguarde 2 s e meça por 10 segundos usando um luminômetro.
8. Exporte os dados de leitura de luminescência para um formato de arquivo desejável.
9. Determine a taxa de tradução relativa do mRNA de 12A-Fluc em células HeLa não infectadas e infectadas por VACV, dividindo o valor de Fluc pelo valor de controle interno Rluc.
   NOTA: A Figura 2 mostra a análise passo a passo dos dados brutos para obter a atividade relativa do Fluc.

Tabela 1: Configurações de medição da luciferase – as etapas para a medição da luciferase com o volume ou tempo recomendado.

Passos	Volume/Tempo
Injete o substrato de ensaio de luciferase (Fluc):	30 μL
Tempo de espera / incubação:	2 s
Medição de luminescência (Fluc):	10 s
Substrato Stop & Glo (Rluc):	30 μL
Tempo de espera / incubação:	2 s
Medição de luminescência (Rluc):	10 s

Resultados

Figura 1: Síntese e transfecção de mRNA. (A) Esquema da transcrição in vitro. O DNA amplificado por PCR contendo o gene da luciferase a jusante do 5'-UTR de interesse e o promotor T7 é usado como molde. A RNA polimerase T7 é recrutada para o promotor e adiciona ribonucleotídeos, mostrados em branco, da direção 5' a 3'. Uma vez que o mRNA tem 25-30 nt de comprimento, a tampa ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microplaca de poliestireno de fundo plano branco de meia área de 96 poços Corning	Corning	3693	Placa branca de 96 poços com paredes opacas e fundo sólido
Sistema de ensaio repórter de luciferase dupla	Promega	E1960	Kit de ensaio de luciferase dupla (DLAK)
Luminômetro de microplaca GloMax Navigator	Promega	GM2010	Referido como luminômetro de leitor de placa multimodo
Lipofectamina 2000	Thermo Fisher Científico	11668019	Reagente de transfecção lipídica catiônica
Opti-MEM	Thermo Fisher Científico	31985070	Meios de soro reduzidos