Um método de placa de microtitulação para avaliar a concentração inibitória mínima de um antibiótico

Resumo

Fonte: Ketelboeter, L. M., et al. Métodos para inibir a produção de piomelanina bacteriana e determinar o aumento correspondente na sensibilidade ao estresse oxidativo. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra um método baseado em placas de microtitulação para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) de antibióticos de teste contra bactérias. Ao adicionar uma suspensão do patógeno bacteriano Pseudomonas aeruginosa a uma placa de microtitulação contendo diluições seriadas de um antibiótico de teste e um inibidor da produção de piomelanina pela bactéria, a densidade óptica dos poços é medida para calcular a concentração inibitória mínima do antibiótico e o impacto do inibidor da produção de piomelanina na sensibilidade antibiótica da bactéria.

Protocolo

1. Ensaio de Concentração Inibitória Mínima (CIM) de Antibiótico em Placas de 96 Poços

1. Estabelecer culturas durante a noite das estirpes a testar em LB (Luria-Bertani) com e sem NTBC [2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanodiona).
   nota: Este protocolo é descrito usando o nível representativo de 300 μM NTBC.
   1. Adicionar 300 μM de NTBC a 2 ml de LB. Adicionar um volume equivalente de veículo (dimetilsulfóxido, DMSO) a 2 ml de LB para a condição sem NTBC.
   2. Usando palitos de dente estéreis, inocule os tubos com uma colônia isolada de bactérias. Haverá uma cultura com NTBC e uma cultura sem NTBC para cada cepa. Incubar durante a noite a 37 °C com arejamento utilizando um rotador de cultura de tecidos numa incubadora de ar.
2. No dia seguinte, faça soluções mestre LB + NTBC e LB + DMSO para configurar o ensaio MIC. Adicione NTBC a uma concentração de 600 μM, pois isso será diluído duas vezes quando o inóculo for adicionado, resultando em uma concentração final de 300 μM.
   1. Para testar um antibiótico para uma estirpe, adicione 600 μM de NTBC a 2 ml de LB e misture para fazer a solução principal de NTBC. Adicione um volume equivalente de veículo (DMSO) a 2 ml LB e misture para fazer a solução mestre sem NTBC. Use essas soluções para criar soluções de estoque de antibióticos, bem como para configurar a série de diluição em placas de 96 poços.
      nota: As formulações da solução mestre produzirão soluções extras para explicar os erros de pipetagem. As soluções principais podem ser ampliadas ou reduzidas conforme necessário, dependendo do número de antibióticos e cepas testadas.
3. Preparar as soluções antibióticas nas soluções mestre LB + NTBC ou LB + DMSO.
   nota: A concentração de antibióticos nessas soluções deve ser o dobro da concentração final desejada. Deve ser feita solução suficiente para transferir 100 μl para quatro poços em uma placa de 96 poços.
   1. Preparar a solução-mãe de gentamicina +/- NTBC a 64 μg/ml. Para fazer esta solução, adicione 0,288 μl de estoque de gentamicina (100 mg/ml) a 450 μl LB + NTBC ou LB + DMSO solução mestra.
      NOTA: A concentração máxima de gentamicina para Pseudomonas aeruginosa PAO1 é de 32 μg/ml.
   2. Fazer a solução-mãe de canamicina +/- NTBC a 256 μg/ml. Para fazer esta solução, adicione 3,84 μl de estoque de canamicina (30 mg/ml) a 450 μl LB + NTBC ou LB + DMSO master solutions.
      nota: A concentração máxima de canamicina para P. aeruginosa PAO1 é de 128 μg/ml.
   3. Preparar tobramicina +/- NTBC solução-mãe a 8 μg/ml. Para fazer esta solução, adicione 0,36 μl de estoque de tobramicina (10 mg/ml) a 450 μl LB + NTBC ou LB + DMSO master solutions.
      nota: Para P. aeruginosa PAO1, a concentração máxima de tobramicina é de 4 μg/ml.
      nota: Os antibióticos e as concentrações podem ser ajustados para as bactérias a serem testadas.
4. Adicione 100 μl de cada solução antibiótica 2x a quatro poços em uma placa de 96 poços. Coloque essas soluções na linha A. Por exemplo, a gentamicina deve ser colocada em A1 a A4, a canamicina deve ser colocada em A5 a A8 e a tobramicina deve ser colocada em A9 a A12. Consulte a Figura 1A para obter um diagrama de uma configuração de placa de 96 poços.
   nota: Vários antibióticos podem ser testados em uma placa, mas apenas uma cepa deve ser testada por placa para eliminar o potencial de contaminação cruzada de outras cepas.
5. Adicione 50 μl da solução mestre LB + NTBC ou LB + DMSO às linhas B a H da placa de 96 poços. Certifique-se de que uma placa seja LB + NTBC e uma placa seja LB + DMSO. Veja a Figura 1A.
   1. Use LB + NTBC para os antibióticos em LB + NTBC. Use LB + DMSO para os antibióticos em LB + DMSO.
6. Usando um micropipetador, execute diluições seriais duplas dos antibióticos, transferindo 50 μl da solução da linha A para a linha B. Misture a solução, troque as pontas da pipeta e transfira 50 μl da solução da linha B para a linha C. Repita para as linhas restantes. Após diluição da linha G, remover 50 μl da solução dessa linha e eliminar. Use a linha H como um controle sem antibióticos para o crescimento bacteriano. Veja a Figura 1B.
   NOTA: Cada poço nas linhas A a G agora contém 50 μl de antibiótico em LB + NTBC ou LB + DMSO a 2X a concentração final desejada. A linha H contém LB + NTBC ou LB + DMSO sem antibióticos.
7. Meça o OD₆₀₀ das culturas noturnas. Lave todas as culturas antes de fazer leituras de OD₆₀₀ para eliminar a piomelanina presente no meio.
   1. Lave as culturas centrifugando 1 ml de cultura em uma microcentrífuga a 16.000 x g por 2 min. Remova o sobrenadante com um micropipetador e ressuspenda o pellet celular em 1 ml LB.
8. Diluir as culturas durante a noite para 2,75x10⁵ UFC/ml em LB.
   nota: Suponha que uma unidade OD₆₀₀ seja o equivalente a 1x10⁹ UFC/ml para P. aeruginosa. As conversões de DO para UFC/ml podem ser diferentes noutras bactérias.
9. Adicionar 50 μl da cultura bacteriana diluída ao poço adequado.
   nota: As culturas cultivadas em NTBC devem ser adicionadas aos alvéolos que contêm NTBC e as culturas cultivadas em DMSO devem ser adicionadas aos alvéolos que contêm DMSO. Veja a Figura 1B.
   1. Adicione bactérias a três poços para cada cepa e concentração de antibiótico. Adicione 50 μl de LB ao quarto poço para atuar como controle da contaminação bacteriana. Veja a Figura 1B.
   2. Use um micropipetador multicanal para inocular os poços. Certifique-se de que as pontas das pipetas estejam próximas ao fundo dos poços ao adicionar inóculo para evitar a contaminação dos poços vizinhos.
      nota: A adição de cultura bacteriana aos poços diluirá as concentrações de antibióticos e NTBC em duas vezes.
10. Cubra as placas de 96 poços com parafilme e incube por aproximadamente 24 horas a 37 ° C. Incube as placas de 96 poços estaticamente, em uma incubadora de ar.
11. Examine as placas quanto ao crescimento bacteriano nos poços. A CIM é a concentração mais baixa de antibiótico em que não se observa crescimento bacteriano para as três repetições de cada estirpe.
    1. Examine visualmente a placa quanto ao crescimento ou leia usando um leitor de placas ajustado para OD₆₀₀.

Resultados

Figura 1: Esquema do ensaio MIC de antibióticos Configuração da placa de 96 poços. (A) 100 μl de antibióticos 2x da maior concentração inicial estão na linha A. As linhas B a H são preenchidas com 50 μl de LB + NTBC ou LB + DMSO sem antibióticos. (B) Diluições seriadas duplas são realizadas nas linhas A a G, resultando em 50 μl de antibiótico diluído...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanodiona (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Também chamado de nitisinona. Solúvel em DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 % em peso em H2O. Estabilizado.
gentamicina	Biografia de Ouro	G-400-100	Solúvel em H2O. Esterilize por filtro.
canamicina	Fisher Científico	BP906-5	Solúvel em H2O. Esterilize por filtro.
Tobramicina	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Solúvel em H2O. Esterilize por filtro.