1. Fabricação de hidrogéis finos de poliacrilamida (PA) de duas camadas em placas de vários poços
- Fabricação de hidrogel de poliacrilamida
nota: Veja a Figura 1.
- Prepare soluções aquosas que contenham 3 a 10% de solução de acrilamida estoque a 40% (consulte a Tabela de Materiais) e 0,06 a 0,6% de solução de bisacrilamida estoque a 2% (consulte a Tabela de Materiais) para fabricar hidrogéis de rigidez ajustável variando de 0,6 kPa a 70 kPa. Veja a Tabela 1.
- Para hidrogéis de 0,6 kPa, misture 3% de acrilamida com 0,045% de bis-acrilamida. Para hidrogéis de 3 kPa, misture 5% de acrilamida com 0,074% de bis-acrilamida. Para hidrogéis de 10 kPa, misture 10% de acrilamida com 0,075% de bis-acrilamida. Para hidrogéis de 20 kPa, misture 8% de acrilamida com 0,195% de bis-acrilamida. Para hidrogéis de 70 kPa, misture 10% de acrilamida com 0,45% de bis-acrilamida.
NOTA: Mais detalhes sobre como alcançar a rigidez desejável do hidrogel PA podem ser encontrados em outro lugar.
- Prepare duas soluções aquosas para cada rigidez desejável do hidrogel. Prepare a Solução 1 para ser livre de esferas e a Solução 2 para conter 0.03% de microesferas fluorescentes de 0.1 μm de diâmetro (consulte a Tabela de Materiais).
- Desgaseifique as soluções 1 e 2 por vácuo por 15 min para eliminar o oxigênio que é conhecido por inibir a polimerização das soluções.
- Adicione 0,6% da solução APS estoque de 10 g/mL e 0,43% de tetrametiletilenodiamina (TEMED) à Solução 1 para permitir o início da polimerização. Aja rápido.
- Adicione 3,6 μL da Solução 1 ao centro de cada poço do prato de 24 poços.
- Cubra imediatamente os poços com lamínulas circulares não tratadas de 12 mm e deixe a Solução 1 descansar por 20 min para que ela polimerize completamente.
- Bata suavemente uma agulha de seringa em uma superfície para criar um pequeno gancho em sua ponta para facilitar a remoção das lamínulas. Levante as lamínulas usando a agulha da seringa.
- Adicione 0,6% da solução APS estoque de 10 g/mL e 0,43% de TEMED à Solução 2. Deposite 2,4 μL da mistura no topo da primeira camada em cada poço do prato de 24 poços.
- Cubra a Solução 2 com lamínulas circulares de vidro de 12 mm, pressionando suavemente para baixo usando uma pinça para garantir que a espessura da segunda camada seja mínima. Deixe a Solução 2 polimerizar por 20 min.
- Adicione 500 μL de HEPES 50 mM pH 7,5 a cada um dos poços e, em seguida, remova as lamínulas de vidro com a agulha da seringa e a pinça.
- Esterilização, revestimento de colágeno e equilíbrio de hidrogéis de poliacrilamida
- Exponha os hidrogéis por UV por 1 h na capa de cultura de tecidos para permitir a esterilização.
- Prepare uma mistura de 0,5% de sulfosuccinimidil 6-(4′-azido-2′-nitrofenilamino)hexanoato a 0,5% (Sulfo-SANPAH, consulte a Tabela de Materiais) em DMSO a 1% e HEPES 50 mM pH = 7,5.
- Adicionar 200 μL desta solução à superfície superior dos hidrogéis. Agindo rápido, exponha-os aos raios UV (302 nm) por 10 min para ativá-los.
- Lave os hidrogéis duas vezes com 1 mL de HEPES 50 mM pH = 7,5. Repita se necessário para garantir que qualquer excesso de reticulador seja removido.
- Revestir os hidrogéis com 200 μL de 0,25 mg / mL de colágeno I de cauda de rato (ver Tabela de Materiais) em 50 mM de HEPES. Incubar os hidrogéis, com a solução de colágeno por cima, durante a noite em temperatura ambiente.
nota: Para evitar a desidratação/evaporação, coloque as placas de vários poços em uma contenção secundária e adicione lenços de limpeza de laboratório embebidos em água na periferia interna da contenção.
- Use um microscópio de epifluorescência ou confocal com uma objetiva de 40X para medir a espessura dos hidrogéis. Faça isso localizando as posições z dos planos inferior (onde está a superfície do vidro) e superior do hidrogel (onde a intensidade das esferas fluorescentes é máxima). Em seguida, subtraia as posições z para determinar a altura.
nota: Utilizou-se um microscópio de epifluorescência invertida e uma objetiva de 40X com abertura numérica de 0,65 para medir a espessura dos hidrogéis. As medições de Microscopia de Força Atômica (AFM) também podem ser realizadas neste ponto para confirmar a rigidez exata dos hidrogéis (veja a Figura 2).
- Antes de semear as células de interesse nos hidrogéis, adicione 1 mL de meio nos hidrogéis e incube-os a 37 °C por 30 min a 1 h para garantir o equilíbrio.
nota: Adicionamos mídia completa MCDB-131 porque essa é a mídia em que as células hospedeiras modelo (HMEC-1) foram cultivadas (consulte a etapa 2.1 para obter detalhes).
2. Cultura de células endoteliais microvasculares humanas e semeadura em hidrogéis
- Cultura de células HMEC-1 (endotelial microvascular humana) em meio completo de MCDB-131 contendo meio MCDB-131 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico, 1 μg/mL de hidrocortisona e 2 mM de L-glutamina (ver Tabela de Materiais).
- Divida as culturas confluentes 1:6 a cada 3 - 4 dias e mantenha as células até a passagem 40.
- Um dia antes do experimento, retire as células de seu vaso de cultura usando 0,25% de tripsina / EDTA. Primeiro lave as células e seu recipiente de cultura 1x com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) e, em seguida, adicione a quantidade apropriada de tripsina / EDTA a 0,25% (2 mL por prato de 100 mm ou frasco de 75 cm, 1 mL por prato de 60 mm ou frasco de 25 cm), incubando o frasco a 37 ° C por 5 a 10 min para permitir o desprendimento das células de seu substrato.
- Neutralize a tripsina adicionando o volume desejado de meio completo MCDB-131, pipete suavemente para quebrar os aglomerados de células e, em seguida, coloque a solução em um tubo de centrífuga cônico.
- Agite suavemente a solução de células para garantir que as células sejam distribuídas uniformemente e, em seguida, retire 20 μL da solução e preencha muito suavemente as duas câmaras sob a lamínula de um hemocitômetro de vidro.
- Diluir a solução de células contidas no tubo de centrifugação cónico por centrifugação durante 10 minutos a 500 x g.
- Durante o período de espera de 10 minutos, conte as células usando um hemocitômetro. Use um microscópio, concentre-se nas linhas de grade do hemocitômetro com uma objetiva de 10X e, em seguida, use um contador de contagem manual para contar o número de células em um quadrado de 1 mm x 1 mm.
- Mova o hemocitômetro para outro quadrado de 1 mm x 1 mm, conte as células e repita o processo mais duas vezes. Calcule a média das quatro medidas e multiplique a média por 104. O valor final é o número de células viáveis/ml na suspensão celular que está a ser centrifugada.
- Remova o líquido do tubo cônico da centrífuga, garantindo que o pellet da célula não seja interrompido. Ressuspenda as células no meio completo MCDB-131 a uma concentração de 4 x 105 células/mL.
- Semeie as células em suspensão nos hidrogéis, removendo primeiro o meio com o qual os hidrogéis foram incubados e, em seguida, adicionando 1 mL de suspensão celular em cada hidrogel.
3. Infecção de células endoteliais microvasculares humanas com L. monocytogenes
- Três dias antes da infecção, retire a cepa Lm a ser usada de um estoque de glicerol (armazenado a -80 °C) em uma placa de ágar BHI que contenha 7,5 μg/mL de cloranfenicol e 200 μg/mL de estreptomicina, se apropriado.
nota: A cepa a ser riscada pode ser do tipo selvagem ou mutante, expressando constitutivamente fluorescência (para imunocoloração JAT1045 foi usada) ou expressando fluorescência sob o promotor ActA (para citometria de fluxo ou microscopia de força de tração JAT983 ou JAT985 foram usados).
- Incubar as placas a 37 °C até que se formem colónias discretas (1 - 2 dias).
- No dia anterior à infecção, cultive a cepa desejada durante a noite, agitando-a a 150 rpm a 30 ° C em meio BHI com 7,5 μg / mL de cloranfenicol (se apropriado).
- Coloque 5 mL de meio BHI em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL, adicione 7,5 μg / mL de cloranfenicol (se apropriado) e, em seguida, inocule uma única colônia da placa de ágar usando uma ponta estéril de 10 μL.
- No dia seguinte, imediatamente antes da infecção, medir a densidade óptica da solução bacteriana a 600 nm (OD600) diluindo a amostra 1:5; utilizar uma cubeta contendo apenas BHI para servir de branco.
- Diluir a cultura durante a noite até um OD600 de 0,1 e incubá-la, agitando durante 2 h a 30 °C, em meio BHI com 7,5 μg/ml de cloranfenicol (se for caso disso) para permitir que as bactérias atinjam o crescimento logarítmico.
- Meça o OD600 da solução bacteriana, que deve estar em torno de 0,2 - 0,3. Se o OD600 for maior, dilua-o para 0,2 - 0,3 apenas com BHI.
- Leve 1 mL de solução bacteriana para um tubo de microcentrífuga. Gire para baixo por 4 min a 2.000 x g usando centrifugação em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet bacteriano em 1 mL de PBS de grau de cultura de tecidos, na capa de cultura de tecidos. Lave as bactérias mais duas vezes, girando-as por 4 min a 2.000 x g em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e ressuspenda as bactérias em 1 mL de PBS.
- Prepare a mistura de infecção misturando 10 ou 50 μL da bactéria ressuspensa em PBS com 1 mL de meio completo MCDB-131 para uma multiplicidade de infecções (MOI; ou seja, o número de bactérias por célula hospedeira) de aproximadamente 50 bactérias por célula hospedeira ou 10 bactérias por célula hospedeira.
- Remova o meio dos poços das placas de 24 poços, com cuidado para não romper os hidrogéis ou as células. Lave as células 1x com 1 mL de meio completo MCDB-131 e, em seguida, adicione 1 mL da bactéria a cada poço.
- Cubra o prato com a tampa e embrulhe os pratos com filme plástico de polietileno para evitar vazamentos. Coloque as placas na centrífuga e gire as amostras por 10 min a 200 x g para sincronizar a invasão. Mover as placas para a incubadora de cultura de tecidos e incubá-las durante 30 min a 37 °C.
- Lave as amostras 4x com o meio completo MCDB-131 e mova-as para a incubadora de cultura de tecidos. Após mais 30 minutos, substitua o meio por meio suplementado com 20 μg / mL de gentamicina.
4. Citometria de fluxo para quantificar a suscetibilidade dependente da rigidez da matriz extracelular das células hospedeiras à infecção
- Pese 5 mg de colagenase e coloque-o em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL. Adicione 10 mL de tripsina-EDTA a 0,25% e misture bem.
- 8 h após a infecção, remova o meio dos poços da placa de 24 poços e lave os poços 1x com cultura de tecidos PBS. Remova o PBS dos poços e adicione 200 μL da mistura tripsina-EDTA / colagenase a cada poço. Coloque-o na incubadora de cultura de tecidos por 10 minutos para permitir o descolamento total das células.
- Use uma pipeta nova para cada poço e pipete a mistura para cima e para baixo 8x. Seja gentil para não danificar as células. Adicione 200 μL de meio completo a cada poço para neutralizar a tripsina.
- Transfira a solução celular de 400 μL de cada poço para um tubo de poliestireno de 5 mL com uma tampa de filtro de célula de 35 μm (consulte a Tabela de Materiais).
- Analise de 10.000 a 20.000 células por amostra por citometria de fluxo. Realize a aquisição de dados por citometria de fluxo e determine a porcentagem de células infectadas por poço usando o software relevante disponível comercialmente. Use os gráficos de dispersão direta versus dispersão lateral para bloquear a maior parte da distribuição das contagens de células.
NOTA:: Isso garantirá a análise de células únicas e eliminará detritos ou duplicatas ou trigêmeos de células.
- Meça o sinal de fluorescência das células não infectadas de controle e bloqueie a população de células infectadas, excluindo a autofluorescência.
Tabela 1. Composição de hidrogéis de poliacrilamida (PA) de rigidez variável. Nesta tabela, a porcentagem de solução de acrilamida a 40% e a porcentagem de solução de bisacrilamida a 2% para atingir uma determinada rigidez (módulo de Young, E) são indicadas em diferentes colunas.
| Módulo de Young (E, kPa) | Acrilamida % (de 40% do estoque) | Bisacrilamida % (a partir de 2% do estoque) |
| 0,6 | 3 | 0,045 |
| 3 | 5 | 0,075 |
| 10 | 10 | 0,075 |
| 20 | 8 | 0,195 |
| 70 | 10 | 0,45 |
