Um ensaio para estudar o impacto da rigidez da matriz extracelular na infecção bacteriana

Resumo

Fonte: Bastounis, E. E., et al. Um ensaio baseado em poliacrilamida de formato multipoço para estudar o efeito da rigidez da matriz extracelular na infecção bacteriana de células aderentes. J. Vis. (2018).

Este vídeo demonstra um ensaio para estudar o efeito da rigidez da matriz extracelular (MEC) na infecção bacteriana de células aderentes. Hidrogéis de poliacrilamida de rigidez variável, revestidos com colágeno, são colocados em camadas em uma placa de vários poços para imitar a rigidez da ECM fisiológica. Ao sobrepor células endoteliais humanas nos hidrogéis e infectar as células com bactérias Listeria monocytogenes projetadas para expressar uma proteína fluorescente uma vez intracelular, a citometria de fluxo é usada para comparar bactérias internalizadas em células que residem em hidrogéis mais rígidos versus hidrogéis mais macios.

Protocolo

1. Fabricação de hidrogéis finos de poliacrilamida (PA) de duas camadas em placas de vários poços

1. Fabricação de hidrogel de poliacrilamida
   nota: Veja a Figura 1.
   1. Prepare soluções aquosas que contenham 3 a 10% de solução de acrilamida estoque a 40% (consulte a Tabela de Materiais) e 0,06 a 0,6% de solução de bisacrilamida estoque a 2% (consulte a Tabela de Materiais) para fabricar hidrogéis de rigidez ajustável variando de 0,6 kPa a 70 kPa. Veja a Tabela 1.
      1. Para hidrogéis de 0,6 kPa, misture 3% de acrilamida....

Resultados

Figura 1: Ensaio de infecção bacteriana de células hospedeiras residentes em hidrogéis finos de poliacrilamida (PA) fluorescentes de duas camadas de rigidez variável.As lamínulas de vidro são quimicamente modificadas para permitir a fixação do hidrogel. 3,6 μL de misturas de PA são depositados no fundo do vidro. A mistura é coberta com uma lamínula de vidro circular .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
Pellets de hidróxido de sódio	pescador	S318-500
(3-aminopropil)trietoxissilano	sigma	Resposta 3648
25% de gluteraldeído	sigma	G6257-100ML
40% de acrilamida	sigma	A4058-100ML
Solução de bis-acrilamida (2% p / v)	Fisher Científico	BP1404-250
Microesferas modificadas com carboxilato, 0,1 μm, fluorescentes verde-amareladas (505/515)	Invitrogen	Rolamento F8803
Persulfato de amônio	pescador	BP17925
TEMED	sigma	T9281-25ML
Sulfo-SANPAH	Proteochema	C1111-100MG
Solução de colágeno tipo I de rato	sigma	C3867-1VL
Dimetilsulfóxido (DMSO)	J.T. Padeiro	9224-01
HEPES, ácido livre	J.T. Padeiro	4018-04
Meio L-15 de Leibovitz, sem vermelho de fenol	Thermofischer	21083027
MCDB 131 Médio, sem glutamina	Tecnologias de vida	10372019
Soro Fetal Bovino Foundation, Lote: A37C48A	Gêmeos Bio-Produto	900108 500ml
Fator de Crescimento Epidérmico, EGF	sigma	E9644
Hidrocortisona	sigma	H0888
L-Glutamina 200mM	pescador	SH3003401
DPBS 1X	pescador	SH30028FS
Sulfato de gentamicina	MP biomédicos	Rolamento 194530
Cloramfenicol	sigma	C0378-5G
DifcoTM Ágar, granulado	Bd	Rolamento 214530
BBL TM Infusão cérebro-coração	Bd	211059
Hoechst 33342, tricloridrato, trihidrato - 10 mg/ul solução em água	Invitrogen	H3570
Formaldeído 16% grau EM	Microscopia eletrônica	15710-S
Anticorpo anti-Listeria monocytogenes	Abcam	AB35132
Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H + L) de cabra, conjugado Alexa Fluor® 546	Thermofischer	A-11035
0,25% de tripsina-EDTA, vermelho de fenol	Thermofischer	25200056
COLAGENASE DE CLOSTRIDIUM HISTOLÍTICO	sigma	C8051
Sulfato de estreptomicina	Fisher Científico	3810-74-0
sacarose	Calbioquímica	8510
Dodecil sulfato de sódio	Thermofischer	Rolamento 28364
Pó MES	sigma	M3885
Kcl	J.T. Padeiro	3040-05
MgCl2	J.T. Padeiro	2444-1
EGTA	Acros	Nº 40991
Equipamento de laboratório descartável
Lamínulas circulares de vidro de 12 mm	Marca de pescador	12-545-81	N.º 1.5 lamínula | Diâmetro do vidro de 10 mm | Sem revestimento
Placas de 24 poços com fundo de vidro	Mattek	P24G-1.5-13-F
Tubos de poliestireno de 5 ml com uma tampa de filtro de células de 35 μm	falcão	352235
Balões T-25	falcão	353118
Tubos cônicos de 50 ml	falcão	Rolamento 352070
Tubos cônicos de 15 ml	falcão	352196
Pipetas sorológicas descartáveis (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)	falcão	357551
Pipetas de vidro Pasteur	VWR	14672-380
Ponteiras de pipeta (1-200 μl, 101-1000 μl)	Denville	Pág. 1122, pág. 1126
Luvas de exame sem pó	Microflex	XC-310
Cuvetes bactérias	Sarstedt	67.746
Lâminas	VWR	Rolamento 55411-050
Agulha de seringa	Bd	305167
0.2um esterilizando garrafas	Thermo Científico	Rolamento 566-0020
Seringas de 20 ml	Bd	Rolamento 302830
Filtros 0.2um	Thermo Científico	Rolamento 723-2520
varas de madeira	Grainger	42181501
Rolopack	Santa Cruz Biotecnologias	SC-3687
Bactérias de placas	falcão	351029
Equipamento de laboratório grande/não descartável
Capuz de cultura de tecidos	padeiro	SG504
Hemacitômetro	sigma	Z359629
Incubadora de bactérias	Thermo Científico	IGS180
Incubadora de cultura de tecidos	NuAire	NU-8700
Câmara de vácuo/desgaseificador	Belarte	Nº 42025	37 °C e 5% de CO2
Microscópio de epifluorescência Nikon Diaphot 200 invertido	Nikon	NIKON-DIAPHOT-200
Incubadora de gaiola	Haison	costume
Analisador Scanford FACScan	Stanford e Cytek atualizaram o FACScan	costume
Auxiliar de pipeta	Drummond	4-000-110
Pipetadores (10 μl, 200 μl, 1000ul)	Gilson	F144802, F123601, F123602
Medidor de pH	Mettler Toledo	30019028
fórceps	Festa	11000-12
Frasco de 1 L	Marca de pescador	FB5011000
Máquina de autoclave	Amsco	3021
Placa magnética de agitação	Bellco	7760-06000
Barras de agitação magnéticas	Bellco	1975-00100
espectrofotômetro	Beckman	DU 640
Analisador Scanford FACScan	Cytek Biociências	FACScan atualizado personalizado de Stanford e Cytek
software
Software para microscópio (μManager)	Imagem aberta
Laboratório de Matemática	Matlab Inc
Flowjo	FlowJo, LLC
Software de análise de imagem automatizada, CellC	https://sites.google.com/site/cellcsoftware/		O software está disponível gratuitamente. Arquivos executáveis e códigos-fonte do MATLAB podem ser obtidos em https://sites.google.com/site/cellcsoftware/