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1. Fabricação de hidrogéis finos de poliacrilamida (PA) de duas camadas em placas de vários poços
- Dissolva o persulfato de amônio (APS) em água ultrapura destilada para atingir uma concentração final de 10 g/mL. Alíquota e conservar a solução a 4 °C para utilização a curto prazo (3 semanas).
NOTA: A solução acima pode ser preparada antes da fabricação do hidrogel.
- Ativação de vidro de pratos de 24 poços
- Incubar placas de fundo de vidro de 24 poços com poços de 13 mm de diâmetro (ver Tabela de Materiais) por 1 h com 500 μL de hidróxido de sódio (NaOH) 2 M por poço à temperatura ambiente.
- Enxágue os poços 1x com água ultrapura e, em seguida, adicione 500 μL de trietoxissilano a 2% (3-aminopropil) (consulte a Tabela de Materiais) em etanol a 95% em cada poço por 5 min.
- Enxágue os poços 1x novamente com água e adicione 500 μL de glutaraldeído a 0,5% em cada poço por 30 min. Enxágue os poços 1x com água e seque-os a 60 °C sem tampa.
- Fabricação de hidrogel de poliacrilamida
NOTA: Consulte a Figura 1.
- Prepare soluções aquosas que contenham 3 a 10% de solução de acrilamida estoque a 40% (consulte a Tabela de Materiais) e 0,06 a 0,6% de solução de bisacrilamida estoque a 2% (consulte a Tabela de Materiais) para fabricar hidrogéis de rigidez ajustável variando de 0,6 kPa a 70 kPa. Veja a Tabela 1.
- Para hidrogéis de 0,6 kPa, misture 3% de acrilamida com 0,045% de bis-acrilamida. Para hidrogéis de 3 kPa, misture 5% de acrilamida com 0,074% de bis-acrilamida. Para hidrogéis de 10 kPa, misture 10% de acrilamida com 0,075% de bis-acrilamida. Para hidrogéis de 20 kPa, misture 8% de acrilamida com 0,195% de bis-acrilamida. Para hidrogéis de 70 kPa, misture 10% de acrilamida com 0,45% de bis-acrilamida.
NOTA: Mais detalhes sobre como alcançar a rigidez desejável do hidrogel PA podem ser encontrados em outro lugar.
- Prepare duas soluções aquosas para cada rigidez desejável do hidrogel. Prepare a Solução 1 para ser livre de esferas e a Solução 2 para conter 0.03% de microesferas fluorescentes de 0.1 μm de diâmetro (consulte a Tabela de Materiais).
- Desgaseifique as soluções 1 e 2 por vácuo por 15 min para eliminar o oxigênio que é conhecido por inibir a polimerização das soluções.
- Adicione 0,6% da solução APS estoque de 10 g/mL e 0,43% de tetrametiletilenodiamina (TEMED) à Solução 1 para permitir o início da polimerização. Aja rápido.
- Adicione 3,6 μL da Solução 1 ao centro de cada poço da placa de 24 poços (consulte a etapa 1.2 para sua preparação).
- Cubra imediatamente os poços com lamínulas circulares não tratadas de 12 mm e deixe a Solução 1 descansar por 20 min para que ela polimerize completamente.
- Bata suavemente uma agulha de seringa em uma superfície para criar um pequeno gancho em sua ponta para facilitar a remoção das lamínulas. Levante as lamínulas usando a agulha da seringa.
- Adicione 0,6% da solução APS estoque de 10 g/mL e 0,43% de TEMED à Solução 2. Deposite 2,4 μL da mistura no topo da primeira camada em cada poço do prato de 24 poços.
- Cubra a Solução 2 com lamínulas circulares de vidro de 12 mm, pressionando suavemente para baixo usando uma pinça para garantir que a espessura da segunda camada seja mínima. Deixe a Solução 2 polimerizar por 20 min.
- Adicione 500 μL de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) 50 mM pH 7,5 a cada um dos alvéolos e, em seguida, remova as lamínulas de vidro com a agulha da seringa e a pinça.
- Esterilização, revestimento de colágeno e equilíbrio de hidrogéis de poliacrilamida
- Exponha os hidrogéis por UV por 1 h na capa de cultura de tecidos para permitir a esterilização.
- Prepare uma mistura de 0,5% de sulfosuccinimidil 6-(4′-azido-2′-nitrofenilamino)hexanoato a 0,5% em peso/volume (Sulfo-SANPAH, consulte a Tabela de Materiais) em 1% de dimetilsulfóxido (DMSO) e 50 mM HEPES pH = 7,5.
- Adicionar 200 μL desta solução à superfície superior dos hidrogéis. Agindo rápido, exponha-os aos raios UV (302 nm) por 10 min para ativá-los.
- Lave os hidrogéis duas vezes com 1 mL de HEPES 50 mM pH = 7,5. Repita se necessário para garantir que qualquer excesso de reticulador seja removido.
- Revestir os hidrogéis com 200 μL de 0,25 mg / mL de colágeno I de cauda de rato (ver Tabela de Materiais) em 50 mM de HEPES. Incubar os hidrogéis, com a solução de colágeno por cima, durante a noite em temperatura ambiente.
NOTA: Para evitar a desidratação/evaporação, coloque as placas de vários poços em uma contenção secundária e adicione lenços de limpeza de laboratório embebidos em água na periferia interna da contenção.
- Use um microscópio de epifluorescência ou confocal com uma objetiva de 40X para medir a espessura dos hidrogéis. Faça isso localizando as posições z dos planos inferior (onde está a superfície do vidro) e superior do hidrogel (onde a intensidade das esferas fluorescentes é máxima). Em seguida, subtraia as posições z para determinar a altura.
NOTA: Utilizou-se um microscópio de epifluorescência invertida e uma objetiva de 40X com abertura numérica de 0,65 para medir a espessura dos hidrogéis. As medições de Microscopia de Força Atômica (AFM) também podem ser realizadas neste ponto para confirmar a rigidez exata dos hidrogéis (veja a Figura 2).
- Antes de semear as células de interesse nos hidrogéis, adicione 1 mL de meio nos hidrogéis e incube-os a 37 °C por 30 min a 1 h para garantir o equilíbrio.
NOTA: Adicionamos a mídia completa do MCDB-131 porque essa é a mídia em que as células hospedeiras modelo (HMEC-1) foram cultivadas (consulte a etapa 2.1 para obter detalhes).
2. Cultura de células endoteliais microvasculares humanas e semeadura em hidrogéis
- Cultura de células HMEC-1 (endotelial microvascular humana) em meio completo de MCDB-131 contendo meio MCDB-131 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico, 1 μg/mL de hidrocortisona e 2 mM de L-glutamina (ver Tabela de Materiais).
- Divida as culturas confluentes 1:6 a cada 3-4 dias e mantenha as células até a passagem 40.
- Um dia antes do experimento, retire as células de seu vaso de cultura usando 0,25% de tripsina / EDTA. Primeiro, lave as células e seu vaso de cultura 1x com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) e, em seguida, adicione a quantidade apropriada de tripsina / EDTA a 0,25% (2 mL por placa de 100 mm ou frasco de 75 cm, 1 mL por placa de 60 mm ou frasco de 25 cm), incubando o frasco a 37 ° C por 5 a 10 min para permitir o desprendimento das células de seu substrato.
- Neutralize a tripsina adicionando o volume desejado de meio completo MCDB-131, pipete suavemente para quebrar os aglomerados de células e, em seguida, coloque a solução em um tubo de centrífuga cônico.
- Agite suavemente a solução de células para garantir que as células sejam distribuídas uniformemente e, em seguida, retire 20 μL da solução e preencha muito suavemente as duas câmaras sob a lamínula de um hemocitômetro de vidro.
- Diluir a solução de células contidas no tubo de centrifugação cónico por centrifugação durante 10 minutos a 500 x g.
- Durante o período de espera de 10 minutos, conte as células usando um hemocitômetro. Use um microscópio, concentre-se nas linhas de grade do hemocitômetro com uma objetiva de 10X e, em seguida, use um contador de contagem manual para contar o número de células em um quadrado de 1 mm x 1 mm.
- Mova o hemocitômetro para outro quadrado de 1 mm x 1 mm, conte as células e repita o processo mais duas vezes. Calcule a média das quatro medidas e multiplique a média por 104. O valor final é o número de células viáveis/ml na suspensão celular que está a ser centrifugada.
- Remova o líquido do tubo cônico da centrífuga, garantindo que o pellet da célula não seja interrompido. Ressuspenda as células no meio completo MCDB-131 a uma concentração de 4 x 105 células/mL.
- Semeie as células em suspensão nos hidrogéis, removendo primeiro o meio com o qual os hidrogéis foram incubados e, em seguida, adicionando 1 mL de suspensão celular em cada hidrogel.
3. Infecção de Células Endoteliais Microvasculares Humanas com Listeria monocytogenes (Lm)
- Preparação antecipada
NOTA: Prepare as seguintes soluções com antecedência.
- Estoques de estreptomicina, cloranfenicol e gentamicina
- Prepare 50 mg / mL de soluções estoque de estreptomicina pesando 0,5 g de sulfato de estreptomicina e dissolvendo-o completamente em 10 mL de água ultrapura.
- Prepare 7,5 mg / mL de soluções estoque de cloranfenicol pesando 75 mg de cloranfenicol e dissolvendo-o completamente em 10 mL de etanol a 100%.
- Prepare 20 mg / mL de soluções estoque de gentamicina pesando 0,2 g de sulfato de gentamicina e dissolvendo-o completamente em 10 mL de água ultrapura.
- Filtre-esterilize todas as soluções de estoque com um filtro de seringa de 0,2 μm e armazene-as a -20 ° C para uso a longo prazo (1 - 2 meses).
- Meio de infusão cérebro-coração (BHI) e placas de ágar
- Localize dois balões de 1 L e adicione uma barra de agitação magnética dentro de cada balão.
- Para os meios BHI, adicionar 37 g de pó BHI num balão e adicionar água ultrapura até 1 l. Misturar vigorosamente a solução, colocando o balão numa placa de agitação magnética até que o pó se dissolva.
- Para as placas de ágar BHI, adicionar 37 g de pó BHI e 15 g de ágar granulado (ver Tabela de Materiais) no segundo balão e adicionar água ultrapura até 1 l. Misturar vigorosamente a solução, colocando o balão numa placa de agitação magnética até que o pó se dissolva.
- Aperte as tampas dos frascos com pouca força e autoclave as soluções usando a configuração de líquido ou de acordo com as especificações da autoclave.
- Retirar a solução do autoclave e, em seguida, arrefecer a solução de ágar-BHI a 55 °C. Se o meio BHI no frasco de 1 L for mantido estéril, pode ser utilizado até um mês.
- Para preparar as placas de ágar-BHI para bactérias, adicione primeiro antibióticos, se apropriado, ao frasco que contém BHI e ágar (dependendo das estirpes bacterianas a cultivar). Coloque brevemente o balão em uma placa de agitação magnética para permitir uma mistura rápida.
NOTA: Os antibióticos usados aqui são específicos para as cepas Lm usadas, mas quaisquer antibióticos necessários podem ser usados em placas de ágar BHI. Adicionamos estreptomicina a uma concentração de 200 μg/mL e cloranfenicol a uma concentração de 7,5 μg/mL porque as cepas de 10403S Lm são resistentes à estreptomicina. Essas cepas foram conjugadas com um plasmídeo que contém o quadro de leitura aberta da cloranfenicol acetiltransferase, daí a resistência ao cloranfenicol.
- Despeje a mistura em placas de cultura de bactérias de poliestireno de 10 cm (aproximadamente 20 mL por placa). Para se livrar das bolhas, chame a superfície superior das placas brevemente. Resfrie os pratos durante a noite em temperatura ambiente.
- No dia seguinte, feche as placas secas e guarde-as a 4 °C.
- Infecção de células endoteliais microvasculares humanas com L. monocytogenes
- Três dias antes da infecção, retire a cepa Lm a ser usada de um estoque de glicerol (armazenado a -80 °C) em uma placa de ágar BHI que contenha 7,5 μg/mL de cloranfenicol e 200 μg/mL de estreptomicina, se apropriado.
NOTA: A cepa a ser riscada pode ser do tipo selvagem ou mutante, expressando constitutivamente fluorescência (para imunocoloração JAT1045 foi usada) ou expressando fluorescência sob o promotor ActA (para citometria de fluxo ou microscopia de força de tração JAT983 ou JAT985 foram usados).
- Incubar as placas a 37 °C até que se formem colónias discretas (1 - 2 dias).
- No dia anterior à infecção, cultive a cepa desejada durante a noite, agitando-a a 150 rpm a 30 ° C em meio BHI com 7,5 μg / mL de cloranfenicol (se apropriado).
- Coloque 5 mL de meio BHI em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL, adicione 7,5 μg / mL de cloranfenicol (se apropriado) e, em seguida, inocule uma única colônia da placa de ágar usando uma ponta estéril de 10 μL.
- No dia seguinte, imediatamente antes da infecção, medir a densidade óptica da solução bacteriana a 600 nm (OD600) diluindo a amostra 1:5; utilizar uma cubeta contendo apenas BHI para servir de branco.
- Diluir a cultura durante a noite até um OD600 de 0,1 e incubá-la, agitando durante 2 h a 30 °C, em meio BHI com 7,5 μg/ml de cloranfenicol (se for caso disso) para permitir que as bactérias atinjam o crescimento logarítmico.
- Meça o OD600 da solução bacteriana, que deve estar em torno de 0,2-0,3. Se o OD600 for maior, dilua-o para 0,2 - 0,3 apenas com BHI.
- Leve 1 mL de solução bacteriana para um tubo de microcentrífuga. Gire para baixo por 4 min a 2.000 x g usando centrifugação em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet bacteriano em 1 mL de PBS de grau de cultura de tecidos, na capa de cultura de tecidos. Lave as bactérias mais duas vezes, girando-as por 4 min a 2.000 x g em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e ressuspenda as bactérias em 1 mL de PBS.
- Prepare a mistura de infecção misturando 10 ou 50 μL da bactéria ressuspensa em PBS com 1 mL de meio completo MCDB-131 para uma multiplicidade de infecções (MOI; ou seja, o número de bactérias por célula hospedeira) de aproximadamente 50 bactérias por célula hospedeira ou 10 bactérias por célula hospedeira.
- Remova o meio dos poços das placas de 24 poços, com cuidado para não romper os hidrogéis ou as células. Lave as células 1x com 1 mL de meio completo MCDB-131 e, em seguida, adicione 1 mL da bactéria a cada poço.
- Conservar alguma mistura de infeção (pelo menos 100 μL) para a determinação do MOI (ver passo 3.3).
- Cubra o prato com a tampa e embrulhe os pratos com filme plástico de polietileno para evitar vazamentos. Coloque as placas na centrífuga e gire as amostras por 10 min a 200 x g para sincronizar a invasão. Mover as placas para a incubadora de cultura de tecidos e incubá-las durante 30 min a 37 °C.
- Lave as amostras 4x com o meio completo MCDB-131 e mova-as para a incubadora de cultura de tecidos. Após mais 30 minutos, substitua o meio por meio suplementado com 20 μg / mL de gentamicina.
- Determinação da multiplicidade de infecção (MOI)
- Durante a incubação inicial de 30 minutos das células hospedeiras com a bactéria, prepare diluições seriadas de 10 vezes da mistura de infecção para determinar o MOI. Faça diluições de 10 vezes misturando 100 μL da mistura de infecção com 900 μL de 1x PBS (diluição de 10-1). Em seguida, misture 100 μL da diluição 10-1 com 900 μL de PBS (diluição 10-2).
- Continue até obter uma diluição de 10-5.
NOTA: Todas as soluções precisam ser bem misturadas antes de diluí-las, e pontas de pipeta limpas devem ser usadas em cada etapa.
- Uma vez feitas as diluições, coloque 100 μL das diluições 10-2 - 10-5 no centro das placas BHI / ágar / cloranfenicol / estreptomicina (se apropriado).
- Faça um espalhador com uma pipeta de vidro usando fogo para dobrar a pipeta para criar um gancho. Mergulhe a pipeta em etanol 100% para esterilização e, em seguida, queime o etanol com uma chama.
- Assim que o espalhador esfriar, espalhe as diluições bacterianas homogeneamente nas placas a partir da diluição 10-5 e passando para as misturas mais concentradas. Incubar as placas de cabeça para baixo a 37 °C durante 2 dias.
- Em função da densidade das colónias, determinar o número de colónias das placas de diluição 10-3 e 10-4 ou 10-4 e 10-5. Calcule o MOI da seguinte forma:
número de colónias × factor de diluição ÷ volume inicial adicionado = número de unidades formadoras de colónias (UFC) por μL
número de UFC por μL × volume de mistura de bactérias por poço = número de UFC por poço
número de UFC por poço × volume de células por poço = número de bactérias por célula
NOTA: CFU significa unidades formadoras de colônias.
- Calcule a média dos MOIs de duas placas para obter os MOIs finais.
4. Microscopia quantitativa de lapso de tempo para avaliar a rigidez da matriz extracelular
Prepare os hidrogéis PA em uma placa de 24 poços (consulte a etapa 1), semeie células HMEC-1 (consulte a etapa 2) e cultive culturas JAT983 durante a noite, conforme descrito acima (consulte a etapa 3).
- No dia da infecção, prepare a mistura de infecção misturando 10 μL de pellet bacteriano por mL de meio completo MCDB-131. Remova cuidadosamente o meio dos poços das placas de 24 poços e adicione 1,9 mL do meio completo do MCDB-131 e 0,1 mL da mistura bacteriana a cada poço.
NOTA: O MOI mais baixo usado neste ensaio é necessário para analisar eventos de disseminação que começam com uma única bactéria invadindo uma célula hospedeira.
- Cubra a placa com a tampa e feche-a com um filme plástico para evitar vazamentos. Coloque as placas na centrífuga e gire as amostras por 10 min a 200 x g para sincronizar a invasão.
- Mova as placas para a incubadora de cultura de tecidos e incube-as por 5 min.
- Lave as amostras 4x com meio e mova-as para a incubadora de cultura de tecidos. Após mais 5 a 7 minutos, substitua o meio por meio suplementado com 20 μg / mL de gentamicina.
- Incube a placa na incubadora por mais 5 h para permitir que o promotor actA ligue e conduza a expressão do quadro de leitura aberto mTagRFP.
- Prepare um meio de microscopia ao vivo suplementando a L-15 de Leibovitz com 10% de soro fetal bovino, 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico e 1 μg/mL de hidrocortisona.
NOTA: O L-15 já contém 2 mM de L-glutamina, portanto, não é necessário adicionar mais como no caso do meio MCDB-131.
- Misture 1 μL de corante Hoechst de 1 mg / mL com 1 mL de meio completo L-15 e adicione-o a cada poço para corar os núcleos das células. Colocar as células na incubadora de cultura de tecidos por 10 min e, em seguida, substituir em cada poço o meio completo L-15 por 1 mL de meio completo L-15 suplementado com 20 μg/mL de gentamicina. Cobrir a placa com a tampa e colocá-la numa câmara ambiental de microscópio (ver Tabela de Materiais) equilibrada a 37 °C.
NOTA: Para a imagem, um microscópio de epifluorescência invertida foi usado com uma câmera CCD (ver Tabela de Materiais) e uma objetiva de ar fluorita de plano de ar 20X com 0,75 NA. A potência foi ajustada para 50% e o tempo de exposição para 50 ms. Os filtros de microscópio usados para mCherry são 470/525 nm para excitação e emissão, respectivamente.
- Crie imagens de várias posições a cada 5 minutos usando um recurso de foco automático para monitorar como o Lm se espalhou através de monocamadas HMEC-1 semeadas em hidrogéis de rigidez variável.
NOTA: O L-15 é tamponado com HEPES, portanto, não é necessário usar CO2 durante a imagem.
Tabela 1. Composição de hidrogéis de poliacrilamida (PA) de rigidez variável. Nesta tabela, a porcentagem de solução de acrilamida a 40% e a porcentagem de solução de bisacrilamida a 2% para atingir uma determinada rigidez (módulo de Young, E) são indicadas em diferentes colunas.
| Módulo de Young (E, kPa) | Acrilamida % (de 40% do estoque) | Bisacrilamida % (a partir de 2% do estoque) |
| 0,6 | 3 | 0,045 |
| 3 | 5 | 0,075 |
| 10 | 10 | 0,075 |
| 20 | 8 | 0,195 |
| 70 | 10 | 0,45 |
